基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定

• 作者: 刘媛 刘贤金 寇莉萍 张存政 张留圈 张霄 徐重新 谢雅晶
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 磁珠 Cry1Ac毒素 单链抗体 双抗夹心ELISA
• 年，卷（期）: 2014,（9）
• 所属期刊栏目: 贮藏?保鲜?加工
• 页码范围: 1802-1810
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.09.015

摘要

【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略，建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法，为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法，经过4轮筛选后，对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定，通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆，并对其进行PCR鉴定和DNA测序，确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为“捕获抗体”，Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为“检测抗体”，建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原，利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示，相对产出率随着筛选轮数的增加而提高，第4轮较第1轮提高了42倍；单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体，以试验孔OD450/阴性孔 OD450大于2.1为阳性标准，从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落，经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆，分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中，hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现，在935 bp处均有明显的目的条带，通过对其进行测序和氨基酸序列比对，最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后，经1 mmol·L-1 IPTG诱导表达，于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测，hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后，利用单链抗体为“捕获抗体”，多抗为“检测抗体”，建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25-2.43μg·mL-1线性检测范围内，线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564)，检测限为1.08 ng·mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法，建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法，为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。