RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

• 作者: 宋扬 张恩丰 徐韬 杨明坤 王国旗 盛伟斌
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 组织构建 组织工程 组织构建基础实验 RNA干扰 端粒酶 端粒酶反转录酶 质粒载体 慢病毒 星形胶质细胞 短发夹RNA 脊髓损伤 胶质瘢痕 国家自然科学基金
• 年，卷（期）: 2014,（11）
• 所属期刊栏目: 技术与方法 -- 组织构建细胞学实验
• 页码范围: 1724-1729
• 页数: 6页
• 分类号: R394.2
• 字数: 6136字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.11.014

摘要

背景：端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)对端粒酶活化起重要作用，但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。<br>　　目的：构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体，并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。<br>　　方法：通过设计合成出shRNA-TERT序列，经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒，经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞，包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度，再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞，实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平，并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。<br>　　结果与结论：基因测序鉴定证明，pLentilox3.7U6-TERT 重组质粒构建成功，并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明，Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后，对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%，Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实，实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒，感染大鼠脊髓星形胶质细胞后，该载体可以有效抑制TERT的表达。

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	盛伟斌	新疆医科大学第一附属医院脊柱外科	155	985	15.0	21.0
2	杨明坤	四川省巴中市中心医院骨科	9	20	3.0	4.0
3	徐韬	新疆医科大学第一附属医院脊柱外科	40	170	9.0	11.0
4	宋扬	新疆医科大学第一附属医院脊柱外科	2	9	2.0	2.0
5	王国旗	新疆医科大学第一附属医院脊柱外科	5	41	4.0	5.0
6	张恩丰	新疆医科大学第一附属医院脊柱外科	3	13	2.0	3.0