人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因慢病毒表达载体的构建

• 作者: 李丽玲 杨冬华 梁旭竞 汤绍辉 金玲 陈友鹏 陈小佳
• 来源期刊: 中国组织工程研究与临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 端粒酶反转录酶 绿色荧光蛋向 慢病毒载体
• 年，卷（期）: 2009,（15）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 2931-2936
• 页数: 6页
• 分类号: R349.83
• 字数: 6670字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1673-8225.2009.15.028

摘要

背景:外源性端粒酶反转录酶的表达可重建端粒酶活性,诱导细胞永生化.目的:采用慢病毒载体作为基因转移载体,克隆人端粒酶反转录酶的编码区全序列,同时选用绿色荧光蛋白作为目的基因表达标志物,构建人端粒酶反转录酶慢病毒表达载体.设计、时间及地点:开放性实验,单一样本观察,于2007-06/2008-03在暨南大学生物工程研究所及暨南大学附属第一医院中心实验室完成.材料:pBABE-puro-hTERT质粒由Robert Weinberg教授惠赠,质粒pDONR221,pLenti6N5一DEST,ccdB Survival,Stb13及293FT细胞由暨南大学生物工稃研究所提供.方法:以pBABE-puro-hTERT质粒为模板聚合酶链反应法获取目的基因人端粒酶反转录酶(包含酶切位点BglⅡ、HindⅢ),通过BP反应克隆至pDONR221,以质粒pEGFP-N1为模板,以聚合酶链反应法获取目的基因增强型绿色荧光蛋白(包含酶切位点Hind Ⅲ,Bg Ⅲ),通过酶切及连接反应形成pDONR221一hTERT-EGFP.采用LR重组酶将pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6/V5-DEST进行重组反应,形成pLenti6/V5一DEST-hTERT-EGFP.将PLenti6N5一DEST-hTERT-EGFP与包装质粒混合,利用脂质体共转染293FT细胞.主要观察指标:通过酶切、聚合酶链式反应及测序验证重组质粒pDONR221-hTERT-EGFP和pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP是否构建成功.包装重组慢病毒,应用荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白在293FT细胞中的表达情况.结果:测序发现慢病毒入门载体pDONR221包含目的基因hTERT 1547位点存在点突变(原碱基A变成G),通过定点突变技术成功诱变并鉴定慢病毒表达载体pLenti6N5-DEST-hTERT-EGFP成功构建.转染后的293FT细胞在荧光显微镜下观察可见强绿色荧光.结论:实验成功构建了人端粒酶反转录酶和绿色荧光蛋白融合基因的慢病毒表达载体,为人端粒酶反转录酶稳定转染提供快速、简洁的方法.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	杨冬华	暨南大学附属第一医院感染科	108	432	10.0	15.0
2	汤绍辉	暨南大学附属第一医院感染科	164	444	9.0	14.0
3	陈小佳	暨南大学生物工程研究所	31	287	9.0	16.0
4	梁旭竞	暨南大学附属第一医院消化科	30	159	7.0	10.0
5	金玲	暨南大学附属第一医院眼科	30	315	11.0	16.0
6	李丽玲	暨南大学生物工程研究所	4	27	3.0	4.0
7	陈友鹏	暨南大学附属第一医院感染科	40	208	8.0	11.0