苏云金芽胞杆菌晶体蛋白2Ab32(Cry2Ab32)基因的克隆、表达与杀虫活性分析

• 作者: 余宗兰 刘瑶 李巧 李平 贺利业 郑爱萍 黄刚辉 龚莉
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: 苏云金芽胞杆菌 克隆 杀虫活性 晶体蛋白2Ab32(Cry2Ab32)
• 年，卷（期）: 2015,（6）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 798-805
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.06.012

摘要

为了扩充新的鳞翅目杀虫蛋白基因,本研究采用限制性片段长度多态性PCR(PCR-restricted fragment length polymorphisms,PCR-RFLP)方法对苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株BN23-5中所含杀虫晶体蛋白基因进行鉴定和分析.结果表明,该菌株中含有晶体蛋白(crystal,cry)cry2Ab类基因.根据己知cry2Ab类基因编码区设计简并引物,以菌株BN23-5全质粒DNA为模板进行扩增并测序.结果显示,扩增产物为一个完整的cry2Ab类基因,全长1 902 bp,由634个氨基酸组成,氨基酸序列与Cry2Ab1同源性最高(96.5％),命名为cry2Ab32(GenBank登录号:KJ710647).将该基因插入表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-2Ab并转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3),异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导成功表达蛋白,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)验证其相对分子质量为65 kD左右.表达的包涵体蛋白采用饲喂法进行生物活性测定,结果表明,Cry2Ab32对小菜蛾(Plutella xylostella)、玉米螟(Ostrinia fumacalis)和棉铃虫(Helicoverpa armigera)均有杀虫活性,半致死浓度(median lethal concentration, LC50)分别为8.99、19.34和21.24 μg/mL,对甜菜夜蛾Laphygma exigua)的致死率不高,但能明显抑制甜菜夜蛾的生长.cry2Ab32新基因的发现将为重要农业害虫的防治提供更多选择,为进一步研究Cry2Ab类蛋白结构和杀虫机理提供基础资料.