小麦逆境胁迫相关基因TaC2DP1的克隆及表达分析

• 作者: 任江萍 夏国军 尹钧 李永春 牛洪斌 王新国 王翔 肖瑞霞
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 小麦 C2结构域蛋白 基因克隆 表达分析
• 年，卷（期）: 2015,（8）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种?种质资源?分子遗传学
• 页码范围: 1463-1472
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.08.01

摘要

【目的】克隆与逆境胁迫相关的基因，并对其序列特征、进化关系和表达特性进行分析，探讨该基因在小麦抗逆调控过程中的生物学功能，为进一步解析植物的抗逆机制提供候选基因和理论依据。【方法】以 cDNA芯片数据获得的水分胁迫诱导上调表达基因EST序列为探针，对小麦EST数据库进行搜索，筛选与探针同源性在97％以上的EST序列，通过电子克隆结合RT-PCR获得该基因cDNA全长，采用生物信息学软件分析比较克隆基因的保守结构域及序列特征；采用MEGA6.0软件构建该基因的系统进化树；将测序正确的该基因片段通过EcoRⅠ和HindⅢ限制性内切酶酶切连接至原核表达载体pMAL-c2X，重组质粒转化大肠杆菌BL21，经终浓度为0.3 mmol·L-1 IPTG诱导1—5 h后，用SDS-PAGE分析融合蛋白的表达；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析该基因在小麦不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高温和ABA处理下的表达模式。【结果】成功获得小麦cDNA全长序列，命名为TaC2DP1。该基因序列全长为1356 bp，包含一个1209 bp的开放阅读框（ORF），5′端非编码区50 bp，3′端非编码区97 bp，编码402个氨基酸，推导编码蛋白质的预测分子量为43.41 kD，等电点为4.30，属于酸性蛋白，BLAST分析表明，该蛋白含有一个与钙离子结合的结构域，称为C2结构域（C2-domain）。多序列比对及进化树分析表明，TaC2DP1与乌拉尔图小麦TuC2亲缘关系最近，二者具有高度的同源性，其编码的氨基酸一致性达到91%；蛋白质结构预测分析显示TaC2DP1无跨膜螺旋和双硫键，亚细胞定位于细胞质中；成功构建了该基因的原核表达载体pMAL-c2X-TaC2DP1，在IPTG诱导下得到90 kD左右的蛋白，与理论值一致。通过实时荧光定量PCR进行TaC2DP1表达分析，显示该基因在小麦的根、茎、叶、幼穗、未成熟籽粒、胚及胚乳中均有表达，其中在幼穗中表达量最高，在花后5 d籽粒中表达量最低。TaC2DP1可被植物激素ABA诱导而上调表达；干旱胁迫过程中， TaC2DP1受胁迫诱导呈稳定上调表达趋势；高温和低温胁迫过程中，TaC2DP1均在胁迫后的0.5 h迅速诱导上调表达，分别为对照的21和17倍。推测该基因可能参与小麦ABA 信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。【结论】获得小麦TaC2DP1的全长序列，其编码蛋白含有与钙离子结合的C2结构域；在低温、干旱、高温和ABA逆境胁迫下， TaC2DP1属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络，可能在干旱、低温和热胁迫中发挥重要作用。