家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应

• 作者: 刘华伟 唐新 张晓璐 李游山 赵萍
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 家蚕 丝氨酸蛋白酶 中肠 饥饿 表达分析
• 年，卷（期）: 2016,（6）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 1207-1218
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.016

摘要

[目的]分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能.[方法]对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用Clusta1X1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta (DE3)菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白.利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析.[结果]BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1-17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 kD,等电点为7.8.同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62％和63％.这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变.在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体.组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达,且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低.Western blot分析也表明,BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达,且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低.免疫荧光定位结果表明,BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中,进一步证实BmSP141在中肠特异表达.在转录和翻译水平,BmSP141饥饿处理后表达量显著下调,而重新喂食后其表达量上调,表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导.[结论]家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达,在幼虫期食桑期高表达,蛹期和成虫期表达水平较低,受消化道食物的诱导而上调表达,推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	赵萍	西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室	33	235	9.0	14.0
2	刘华伟	西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室	1	1	1.0	1.0
3	唐新	西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室	1	1	1.0	1.0
4	张晓璐	西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室	2	5	1.0	2.0