粉尘螨13.8kDa溶菌酶的克隆表达、纯化鉴定及生物信息学分析

• 作者: 刘志刚 刘晓宇 杨平常 梁志林 邬玉兰 陈思敏
• 来源期刊: 中国人兽共患病学报
• 学科: 医学
• 关键词: 粉尘螨 13.8 kDa溶菌酶(Bac) 原核表达 免疫原性鉴定 生物信息学分析
• 年，卷（期）: 2016,（9）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 779-783,788
• 页数: 6页
• 分类号: R392.8
• 字数: 3990字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1002-2694.2016.09.003

摘要

目的 克隆表达粉尘螨13.8 kDa溶菌酶(Bac)基因,纯化鉴定蛋白的过敏原性,并进行生物信息学分析.方法 挑取经纯培养的粉尘螨,提取总RNA,根据已知基因序列设计引物,经RT-PCR扩增Bac基因片段,产物连入pMD-32T载体中.扩增后,利用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切将目的基因片段连接到Pet-44a表达载体上,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达;间接ELISA法检验重组Bac蛋白特异性过敏原性;clustalw2进行同源性分析,MEGA5工具包来构建系统进化树,ProtParam Tools预测其理化性质,PSIPRED预测其二级结构,SWISS-MODEL预测其三级结构.利用网络服务器IEDB内相关软件和Preprod,对Bac蛋白T细胞抗原表位进行预测.用DNAStar对Bac的B细胞抗原表位进行预测.结果 经测序鉴定,本研究成功克隆出了粉尘螨Bac基因,其开放阅读框396 bp,编码131组氨基酸.将Bac基因导入大肠杆菌E.coliBL21 (DE3),经IPTG诱导后高效表达Bac重组蛋白.该蛋白主要以可溶性形式存在,蛋白分子量约14 kDa.间接ELISA法证明Bac能与粉尘螨过敏患者血清IgE结合.测序发现本实验室克隆的粉尘螨Bac基因与GenBank上公布的GenBank KF113885.1同源性为96％.系统进化树结果显示粉尘螨与屋尘螨亲缘关系比较近.理化性质预测显示Bac蛋白质较稳定.二级结构及三级结构预测结果显示Bac的结构主要以无规则卷曲组成.T细胞抗原表位预测得到4个肽序列(6-14、38-46、85-99、122-130).B细胞抗原表位预测得到6个肽序列(15-30、26 40、44-59、58-73、95-110、101-116).结论 成功克隆并表达了粉尘螨Bac,并证实重组Bac蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究尘螨过敏原的结构成分及其理化性质奠定理论基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	邬玉兰	深圳大学过敏反应和免疫学研究所	36	133	6.0	8.0
2	刘志刚	深圳大学过敏反应和免疫学研究所	324	1724	17.0	23.0
3	刘晓宇	深圳大学过敏反应和免疫学研究所	42	160	7.0	11.0
4	杨平常	深圳大学过敏反应和免疫学研究所	28	67	5.0	6.0
5	梁志林	深圳大学过敏反应和免疫学研究所	5	8	2.0	2.0
6	陈思敏	深圳大学过敏反应和免疫学研究所	2	1	1.0	1.0