Gateway技术构建人RhoD慢病毒表达载体及转染人黑素瘤A375细胞株

• 作者: 倪娜娜 吴琼 周晓伟 孙建方 宋昊 张韡 温斯健 王小坡
• 来源期刊: 中国皮肤性病学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: RhoD基因 慢病毒 载体 Gateway技术 过表达 A375
• 年，卷（期）: 2016,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 998-1002
• 页数: 5页
• 分类号: R739.5
• 语种: 中文
• DOI: 10.13735/j.cjdv.1001-7089.201603058

摘要

目的 构建人RhoD基因的慢病毒载体并进行慢病毒包装和鉴定,转染人黑素瘤细胞A375,使其过表达RhoD蛋白,为后续研究RhoD在黑素瘤中的作用奠定基础.方法 Gateway技术构建携带增强型绿色荧光蛋白EGFP的RhoD慢病毒载体,经PCR及基因测序鉴定后,与辅助质粒pLV/helper-SL3,pLV/helper-SL4及pLV/helper-SL5混合采用脂质体法制备DNA-Lipofectamine 2 000复合物,并共同转染293FT细胞进行慢病毒包装,产生相应慢病毒颗粒,通过定量PCR方法测定病毒滴度.包装好的慢病毒转染人黑素瘤A375细胞,荧光显微镜下观察荧光表达情况,流式细胞仪检测转染效率;实验分为A375(未处理对照组)、A375-EGFP(不合目的基因的空病毒对照组)和A375-RhoD(含RhoD基因的病毒组)三组,采用实时荧光定量PCR (QPCR)及免疫印记法(western blotting,WB)验证RhoD在A375-RhoD组细胞中的过表达.结果 通过PCR、基因测序证实,慢病毒表达载体pLV[Exp]-EGFP/NeoCMV＞ hRhoD构建成功.与辅助质粒共转染293FT细胞包装出具高效感染力的慢病毒,经测定病毒滴度为(5.13±2)×108 TU/mL.转染A375细胞后可见明显的绿色荧光表达,流式检测转染效率大于80％;A375-RhoD组RhoD mRNA及蛋白水平均较A375-EGFP组和A375组细胞中明显增高.结论 成功构建RhoD慢病毒表达载体,包装出具高效感染力的慢病毒颗粒并成功转染人黑素瘤A375细胞,为进一步研究RhoD在黑素瘤中的作用提供实验基础.