利用CRISPR/Cas9基因编辑技术抑制EV71复制

• 作者: 史智扬 吴涛 崔仑标 朱凤才 朱小娟 樊欢 葛以跃 赵康辰 郭喜玲 陈银
• 来源期刊: 中华微生物学和免疫学杂志
• 关键词: CRISPR/Cas9基因编辑技术 肠道病毒71型 病毒复制 抑制
• 年，卷（期）: 2016,（11）
• 所属期刊栏目: 检测技术
• 页码范围: 859-864
• 页数: 6页
• 字数: 4574字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2016.11.012

摘要

目的：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对肠道病毒71型(EV71)的特定基因进行编辑，评价其抑制EV71复制的效应。方法针对EV71的VP4区设计CRISPR/Cas9表达质粒pCas-Guide-GFP-G1及含PAM序列的DNA片段并转染Vero细胞株。采用噻唑蓝( MTT)法测定细胞毒性，转染后接种病毒观察细胞病变作用( CPE)，荧光定量RT-PCR法检测EV71含量，免疫共沉淀结合荧光定量RT-PCR法测定 Cas9-gRNA 在细胞内与 EV71 RNA 特异性结合的能力。结果成功构建pCas-Guide-GFP-G1表达质粒；转染细胞后未见明显细胞毒性效应；细胞转染后接种病毒发现pCas-Guide-GFP-G1+PAM1组细胞病变明显少于其他对照组；培养上清中 EV71含量较对照组降低了40.4%(P=0.056)，细胞中 EV71含量较对照组降低了52.8%(P=0.014)；pCas-Guide-GFP-G1+PAM1组在细胞内与 EV71 RNA 特异性结合能力最高。结论针对 EV71的 VP4基因设计的CRISPR/Cas9表达质粒在特定PAM存在下能通过对EV71基因组的剪切实现抑制EV71病毒复制的作用，可以为EV71治疗提供新的途径。