依赖于靶点稳定性的药物亲和反应实验条件探索

• 作者: 周文霞 张永祥 王黎 肖智勇 谢剑炜
• 来源期刊: 国际药学研究杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 活性小分子化合物 依赖于靶点稳定性的药物亲和反应 靶标发现
• 年，卷（期）: 2016,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 485-490
• 页数: 6页
• 分类号: R965.2
• 字数: 5199字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13220/j.cnki.jipr.2016.03.016

摘要

目的：对依赖于靶点稳定性的药物亲和反应（DARTS）这一靶标发现新技术进行主要影响因素的探索，获得DARTS更适宜的实验条件。方法采用不同浓度的链霉蛋白酶（酶与蛋白质量比1∶100~1∶10000）对Jurkat细胞提取的蛋白混合物进行室温酶解，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和考马斯亮蓝染色，观察不同浓度链霉蛋白酶对蛋白混合物酶解的程度，以确定DARTS适宜的酶解浓度范围。在此基础上，以α-酮戊二酸为研究对象，采用DARTS联合SDS-PAGE，考察不同链霉蛋白酶浓度（酶与蛋白质量比为1∶500~1∶5000）和不同酶解时长（5~30 min）对DARTS结果的影响，获得适宜的酶解条件。选用靶标已知的麦考酚酸，采用上述实验所得的最适酶解条件进行DARTS，验证其可行性。结果采用不同浓度链酶蛋白酶对蛋白混合物进行酶解时，浓度为1∶100的条件下蛋白完全被水解，酶浓度为1∶10000对蛋白混合物无明显水解，酶浓度为1∶500~1∶5000较温和，约可水解蛋白混合物的30%~60%。链霉蛋白酶浓度为1∶1000时，α-酮戊二酸的DARTS中受保护的蛋白条带呈现效果最好；在该酶浓度条件下，适宜的酶解时长为15 min。将以上酶解条件（链霉蛋白酶浓度1∶1000、酶解15 min）运用于麦考酸的DARTS，在4~7×104处可见明显的保护条带，Western免疫印迹法验证结果显示，保护条带中含有麦考酚酸靶蛋白IMPDH 1。结论以α-酮戊二酸为研究对象，获得了蛋白混合物DARTS更适宜的实验条件。