酵母耐盐相关基因HAL1在棉花中的功能表达

• 作者: 叶武威 樊伟丽 王俊娟 王帅 王德龙 穆敏 舒娜 郭丽雪 阴祖军
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 酵母 HAL1 陆地棉 花粉瞬时表达 分子检测
• 年，卷（期）: 2016,（14）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 2651-2661
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.14.001

摘要

[目的]克隆酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)耐盐基因HAL1(halotolerance)并转化棉花,探究该基因在棉花中的功能,进一步探究酵母耐盐相关基因在高等植物中的具体功能.[方法]根据NCBI核酸数据库中酵母耐盐基因HAL1的mRNA全长序列信息,利用RT-PCR技术从酿酒酵母As2.375中克隆该基因.选择酶切位点Xba Ⅰ和Sma Ⅰ对表达载体pBI121::GFP进行双酶切,采用In-Fusion技术构建pBI121-ScHAL1::GFP融合表达载体.以自发荧光较弱的陆地棉品种Y-2067、ZA-23、GZ-2的花粉为材料,用基因枪轰击棉花花粉进行瞬时表达研究.采用基因枪活体转化技术将外源基因表达载体pBI121-HAL1::GFP转化棉花盐敏感材料中s9612,获得T0棉花转基因种子.用100 mmol·L-1 NaCl盐溶液对转基因T0种子进行耐盐性发芽试验,并进行分子检测,对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析.[结果]从酿酒酵母As2.375中克隆耐盐基因ScHAL1,基因全长885 bp,共编码294个氨基酸.对其序列进行分析,发现HAL1蛋白中丝氨酸所占比例最大,整个蛋白呈碱性且带正电,属于亲水性蛋白.根据蛋白二级结构预测结果,推测该蛋白的结构功能域可能主要由无规则卷曲和β-折叠片构成.棉花花粉瞬时表达结果表明,转化HAL1后,3种陆地棉花粉的绿色荧光现象都明显增强,说明该基因可以在这3种陆地棉的花粉中表达.用100 mmol·L-1 NaCl盐溶液对转基因棉花T0种子和受体材料中s9612自交种进行胁迫,发现转基因种子萌发能力明显强于受体材料,表明HAL1可以提高种子耐盐性.根据基因核苷酸序列设计2对引物对T0转基因棉花幼苗进行分子检测,将纯化后的PCR产物进行直接测序,测序结果证明转基因成功.对鉴定出的转基因植株进行叶盘耐盐性分析发现,在600mmol·L-1NaCl和400mmol·L-1NaCl盐胁迫下转基因植株叶盘叶绿素含量均高于对照植株,且在600 mmol·L-1 NaCl溶液胁迫后,转HAL1植株叶绿素含量反而高于400 mmol·L-1NaCl溶液处理后的叶盘.[结论]成功从酿酒酵母中克隆基因HAL1,酵母HAL1对提高棉花耐盐性具有重要作用.