关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响

• 作者: 周迪 夏丹 张雯 桓聪聪 许厚强 赵佳福 陈伟 陈祥
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 关岭牛 转录因子 启动子 MyoD基因家族 报告基因 荧光素酶活性
• 年，卷（期）: 2016,（6）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 1196-1206
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.06.015

摘要

[目的]生肌决定因子(myogenic determination gene,MyoD)家族是肌肉生成过程中参与分子调控作用的一个重要家族.该家族包括MyoD1,Myf5,MyoG和Myf6,只表达在成熟的骨骼肌细胞和其前期细胞中;在其他的非肌细胞中,MyoD基因家族会被抑制.该家族中,MyoD1负责早期胚胎成肌祖细胞的激活并参与胚后骨骼肌的生长、发育和修复等的调节,以维持个体骨骼肌的相对稳定,是启动和维持骨骼肌细胞分化和生长的重要因素,具有尤为重要的作用,已成为研究热点.目前MyoD1在多态性和关联性分析等方面的研究较多,表达调控方面主要是研究小鼠、鸡和猪肌细胞生成机理;在牛上对它的研究主要在转录后和翻译水平的表达,但对MyoD1在转录调控方面的作用机制还不明确.文章研究关岭牛MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响,为探讨牛MyoD1的表达调控机制奠定基础.[方法]通过设计特异性引物克隆关岭牛MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子片段P1和P2;同时利用双酶切的方法分别将CDS区和克隆的启动子序列连入pcDNA3.1(+)和pGL3-Basic基本骨架,构建真核表达载体pcDNA3.1 (+)-Myf5、pcDNA3.1 (+)-Myf6、pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-MyoG和含萤火虫荧光素酶报告基因的报告载体pGL3-P1、pGL3-P2.重组质粒经酶切和测序鉴定后,利用共转染的方法将真核表达载体和报告载体转染小鼠C2C12细胞,30 h后裂解细胞并检测细胞裂解液的双荧光素酶活性.最后根据荧光素酶的相对活性来分析MyoD基因家族对MyoD1启动子活性的影响.[结果]克隆得到的关岭牛MyoD基因家族CDS区和MyoD1启动子序列测序正确,载体pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-MyoG、pGL3-P1和pGL3-P2经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;与相应剂量的对照组相比,转染pcDNA3.1 (+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pcDNA3.1(+)-MyoD后,pGL3-P1的相对荧光素酶活性明显增强,其中,在转染量为200ng时增强作用最强,差异显著(P＜0.05);转染pcDNA3.1(+)-MyoG后,虽然对pGL3-P1的相对荧光素酶活性有增强作用,但差异不显著(P＞ 0.05);而转染pcDNA3.1(+)-Myf5、pcDNA3.1(+)-Myf6、pcDNA3.1(+)-MyoD、pcDNA3.1(+)-MyoG后,pGL3-P2的相对荧光素酶活性变化不明显(P＞0.05).[结论]在小鼠C2C12细胞中外源过表达转录因子MyoD、Myf5、Myf6均能显著提高关岭牛MyoD1启动子全长P1的转录活性(P＜0.05);而外源过表达转录因子MyoD基因家族不能显著提高关岭牛MyoD1启动子核心区P2的转录活性.说明关岭牛MyoD、Myf5和Myf6转录因子与关岭牛MyoD1启动子的作用位点不在其核心启动子区P2上.