鸡miR-17-92基因簇重组腺病毒的制备及其细胞感染率分析

• 作者: 刘静 张文建 李辉 王宁 褚衍凯 邢天宇 闫晓红
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 鸡 miR-17-92基因簇 重组腺病毒 感染率
• 年，卷（期）: 2017,（9）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 1478-1488
• 页数: 11页
• 分类号: S831
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2017.09.011

摘要

MiR-17-92基因簇(miR-17-92 cluster)在哺乳动物的细胞增殖、分化、凋亡、动物发育以及肿瘤发生等过程中发挥重要作用,但是目前miR-17-92基因簇在鸡生长发育中的作用还不清楚.为了阐明miR-17-92基因簇在鸡(Gallus gallus)生长发育中的作用和机制,本研究构建了鸡miR-17-92基因簇的腺病毒表达载体.以鸡基因组为模板,通过PCR扩增出鸡miR-17-92基因簇,将其克隆至腺病毒表达系统穿梭质粒pacAd5 miR-GFP Shuttle Vector,获得重组穿梭质粒pacAd5-MiR-17-92 cluster,进而将其与骨架质粒pacAd5 9.2-100分别经Pac Ⅰ酶切线性化后,共转染AD293细胞,经同源重组获得鸡重组腺病毒rAd5-MiR-17-92 cluster.重组病毒扩增后,采用半数细胞培养物感染量(50％ tissue culture infective dose,TCID50)法测定病毒滴度,采用PCR鉴定和测序鉴定重组腺病毒rAd5-miR-17-92 cluster.结果显示重组腺病毒rAd5-MiR-17-92 cluster和空载体腺病毒rAd-control的滴度均达到l×109 pfu/mL.PCR扩增出了879bp预期大小的特异产物;测序结果与预期序列完全一致.将重组腺病毒感染永生化鸡前脂肪细胞,实时stem-loop RT-PCR检测显示,在重组腺病毒感染细胞miR-17-92基因簇中的miR-19a和miR-20a的表达量为对照组的2.2 ±0.2倍(P＜0.01).将重组腺病毒分别感染4种人胚肾上皮细胞(human embryonic kidney epithelial cell,HEK) 293A、293T、AD293和HEK293、永生化鸡前脂肪细胞(immortalized chicken preadipocytes,ICPA)、鸡成纤维细胞(chicken fibroblast cell,DF1)、人上皮细胞(human epithelial cells,HaCaT)和羊胚胎成纤维细胞(sheep embryonic fibroblasts,SEF),采用荧光显微镜观察判断病毒感染情况.结果发现,重组腺病毒对上述8种细胞的感染效率不同,其中,在4种人胚肾上皮细胞293A、293T、AD293和HEK293中的感染效率很高,在人上皮细胞及羊胚胎成纤维细胞中的感染效率中等,但是在永生化鸡前脂肪细胞和鸡成纤维细胞中的感染效率较低.本研究成功构建的鸡miR-17-92基因簇重组腺病毒为进一步研究miR-17-92基因簇在鸡生长发育中的作用及其机制提供研究工具.