Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

• 作者: 傅政民 冉艳红 冯琳远 孙绮遥 李弘剑 杨少敏 杨晓苹
• 来源期刊: 病毒学报
• 学科: 医学
• 关键词: 慢病毒诱导表达 Tet-On3G pUL23 人巨细胞病毒(HCMV) 慢病毒
• 年，卷（期）: 2017,（4）
• 所属期刊栏目: 人类病毒研究论著
• 页码范围: 550-557
• 页数: 8页
• 分类号: R373.9
• 语种: 中文

摘要

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少.本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型.将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体.运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF.遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达.感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响.限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确.病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高.在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白.这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达.Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间.这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	李弘剑		40	186	8.0	11.0
2	冉艳红		21	164	7.0	12.0
3	杨少敏		1	0	0.0	0.0
4	傅政民		2	0	0.0	0.0
5	孙绮遥		1	0	0.0	0.0
6	冯琳远		2	0	0.0	0.0
7	杨晓苹		2	0	0.0	0.0