用CRISPR/Cas9技术编辑KLF4基因对GES-1细胞生物学行为的影响

• 作者: 任海风 刘亚坤 姜玉 宋乐 张倩 汪思应 范楚苓 赵荣荣 魏道严
• 来源期刊: 安徽医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: KLF4 CRISPR/Cas9 胃癌 GES-1
• 年，卷（期）: 2017,（10）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 1441-1446
• 页数: 6页
• 分类号: R363.14|R363.21
• 字数: 4157字
• 语种: 中文
• DOI: 10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2017.10.006

摘要

目的 采用CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建靶向KLF4的基因编辑质粒,建立CRISPR/Cas9-sgKLF4人正常胃黏膜GES-1细胞株,观察KLF4基因敲除效果及其对细胞生物学行为的影响.方法 设计靶向KLF4基因的sgRNA序列,将合成的片段插入到CRISPR/Cas9质粒骨架载体pX459中,再将重组后的质粒做转化,挑取克隆,扩增后提质粒进行测序验证正确性.将构建好的重组质粒体外转染入人胃黏膜细胞GES-1中,利用嘌呤霉素进行筛选获得KLF4敲除的克隆细胞,应用Western blot技术检测未转染细胞和克隆细胞中KLF4蛋白的表达情况,平板克隆实验检测KLF4敲低后克隆形成能力,MTT实验检测其增殖能力,Transwell实验检测其迁移能力.结果 经测序验证,成功构建了靶向KLF4的重组质粒pX459-KLF4-sgRNA,经Western blot方法验证,转染该重组质粒后人胃黏膜上皮细胞株GES-1的KLF4蛋白表达量明显降低,行为学实验结果表明,GES-1细胞敲低KLF4基因后克隆形成能力、增殖能力以及迁移能力都明显增强.结论 成功构建了靶向KLF4的CRISPR/Cas9基因编辑质粒载体及KLF4基因敲低的稳定细胞株GES-1,KLF4基因敲低后GES-1细胞生物学行为的改变证实其抑癌基因活性.