转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测

• 作者: 刘国振 史佳楠 尹长城 康昊翔 张剑硕 张柳 李莉云 武鹏程 窦世娟 耿广荟 郭亚璐 陈浩 马晓飞 魏健 黄腾
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 水稻 转基因植物 CAS9蛋白质 单克隆抗体 免疫印迹
• 年，卷（期）: 2017,（19）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 3631-3639
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.19.001

摘要

[目的]制备抗CAS9蛋白质的单克隆抗体,建立转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印迹检测方法,了解CAS9蛋白质在转基因水稻中的表达特征.[方法]以带Cas9的质粒DNA为模板,PCR扩增Cas95′端810 bp片段后克隆到pET30a载体中,将酶切验证且序列正确的重组质粒转入表达菌Condon Plus中,经IPTG诱导表达CAS9蛋白质(N端270氨基酸),用纯化的重组蛋白质作为免疫原免疫小鼠,制备单克隆抗体,用免疫印迹分析筛选特异性和灵敏度高的抗体细胞株.用特异性引物PCR扩增转基因水稻的Cas9,用免疫印迹检测转基因水稻中的CAS9蛋白质.将重组CAS9蛋白质和带有CAS9的水稻苗期叶片蛋白质进行平行免疫印迹分析,用Image J软件采集信号绘制CAS9蛋白质的标准曲线,进而对水稻叶片中的CAS9蛋白质进行定量分析.提取单粒稻米的总蛋白质,稀释后用免疫印迹分析CAS9蛋白质的检测下限,提取多个时期、部位的水稻材料的总蛋白质,包括苗期的地上部和地下部,分蘖期的茎、茎节、叶鞘、叶片等,用SDS-PAGE分离后免疫印迹检测比较CAS9蛋白质的表达特征.[结果]通过体外克隆、诱导表达获得了纯化的重组CAS9蛋白质N端片段,免疫小鼠后得到42株阳性杂交瘤细胞株,经筛选鉴定到#12D2细胞株对水稻样品的检测具有较好的特异性和灵敏度.用该抗体通过免疫印迹检测了转基因水稻,所建立的免疫印迹方法对重组CAS9蛋白质的检测下限约为0.25 ng.在水稻苗期叶片中,CAS9蛋白质约占鲜重的0.00005%,可检出单粒稻米8%样品(约2 mg)中的CAS9蛋白质.在苗期地上部CAS9蛋白质的表达丰度高于地下部,分蘖期茎和叶片中表达量较高,根和叶鞘表达量较低.[结论]获得特异性强、灵敏度高的抗CAS9单克隆抗体,建立了检测转基因水稻中CAS9蛋白质的免疫印记方法,揭示了CAS9蛋白质在水稻不同部位的表达特征,并展示了在其他植物中的应用潜力.