利用酵母双杂交系统筛选与草莓镶脉病毒P6蛋白互作的森林草莓寄主因子

• 作者: 左登攀 张享享 李帅 梁伟芳 江彤 胡亚会 蒋西子 陈思涵
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 草莓镶脉病毒 森林草莓 cDNA文库 酵母双杂交 筛选 寄主因子
• 年，卷（期）: 2017,（18）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 3519-3528
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.18.008

摘要

[目的]草莓镶脉病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)是侵染草莓的主要病毒,但其侵染草莓的机制尚不清楚.论文以SVBV的P6蛋白为诱饵筛选森林草莓(Fragaria vesca)cDNA文库的寄主因子,为解析SVBV侵染草莓的分子机制提供理论依据.[方法]SVBV接种森林草莓,提取出现明显症状叶片的总RNA,DnaseI处理后,用SMART法反转录合成ds cDNA,均一化处理cDNA并酶切纯化,将<400 bp的短片段去除,其余片段连接到pGAD-T7质粒载体上,构建森林草莓初级cDNA文库.同时将SVBV P6构建到酵母双杂交诱饵载体pGBK-T7上,再将pGBK-P6和pGBK-T7分别转化酵母菌株AH109,阳性酵母菌株接种SD/-Trp液体培养基,鉴定诱饵载体对酵母细胞的毒性.将转化pGBK-P6的酵母菌分别涂布SD/-Trp、SD/-Leu-Trp和SD/-His-Trp平板,测定菌落生长情况,分析P6蛋白对酵母报告基因的自激活活性.然后用森林草莓初级cDNA文库质粒转化含有诱饵载体pGBK-P6的AH109酵母菌株,共转化子依次涂布SD/-Leu-Trp、SD/-Leu-Trp-His和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal平板,最终筛选蓝色且长势较好的阳性菌落,提取酵母质粒并测序,GenBank中初步比对候选基因,利用Uniprot在线网站的gene ontology(GO)通路注释互作蛋白因子,分析互作蛋白的生物学功能.[结果]3种cDNA文库平均库容超过2.0×106 cfu,平均文库重组率为97%,文库插入片段平均扩增长度>1 kb,表明森林草莓cDNA文库符合试验标准.最终利用SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-α-Gal培养基筛选得到230个酵母阳性克隆,经过序列相似性比对,除去重复序列、载体序列和移码序列,共筛得15个与SVBV P6互作的寄主因子.GO通路注释结果表明这些寄主因子参与了13种生物过程,包括泛素化、转录因子调节、防御反应、代谢过程、氧化还原和胞内氨基酸代谢等过程;这15个寄主因子的分子功能多样,包括乙酰转移酶活性、萜烯合酶活性、脱氢酶活性、金属离子结合活性、蛋白激酶活性和水解酶活性等.[结论]成功构建了森林草莓酵母cDNA文库,筛选出15个与SVBV P6互作的森林草莓寄主因子,为进一步探明SVBV与森林草莓互作的分子机理提供了理论依据.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	江彤	安徽农业大学植物保护学院	62	201	6.0	10.0
2	张享享	安徽农业大学植物保护学院	7	6	1.0	2.0
3	蒋西子	安徽农业大学植物保护学院	5	2	1.0	1.0
4	李帅	安徽农业大学植物保护学院	3	2	1.0	1.0
5	梁伟芳	安徽农业大学植物保护学院	1	1	1.0	1.0
6	陈思涵	安徽农业大学植物保护学院	1	1	1.0	1.0
7	左登攀	安徽农业大学植物保护学院	2	2	1.0	1.0
8	胡亚会	安徽农业大学植物保护学院	3	6	1.0	2.0