人干细胞白血病基因重组慢病毒载体的构建及其在Cajal样间质细胞中的表达

• 作者: 于建超 倪钊 李应龙 李强 王勤章 王新敏 王江平 钱彪
• 来源期刊: 中国现代医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 干细胞白血病基因 慢病毒载体 转染 Cajal样间质细胞
• 年，卷（期）: 2017,（6）
• 所属期刊栏目: 基础研究·论著
• 页码范围: 10-16
• 页数: 7页
• 分类号: R587.2
• 字数: 6014字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1005-8982.2017.06.003

摘要

目的 构建含人干细胞白血病(SCL)基因的重组慢病毒载体,并转染体外培养的Cajal样间质细胞(ICC),为进一步利用慢病毒表达载体行体内实验奠定基础.方法 通过聚合酶链反应(PCR)将人SCL基质粒内的遗传物质扩增,与慢病毒载体质粒GV287-EGFP结合,构建重组质粒GV287-EGFP/SCL,通过Western blot检测及基因测序对阳性克隆进行鉴定,并测定病毒滴度.体外分离、培养及鉴定ICC,重组慢病毒载体以感染复数(MOI)值为0.5、1.0、5.0、10.0、50.0和100.0时,分别转染ICC,通过激光共聚焦显微镜观察,计算不同MOI值的转染效果,确定最佳MOI值.重组慢病毒载体以最佳MOI值感染ICC作为实验组,以空载体转染的ICC(空载体组)及未转染的ICC(空白组)作为对照,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测SCL基因在ICC中的表达.结果 经Western blot检测及基因测序鉴定SCL重组慢病毒表达载体构建成功,并成功转染ICC,激光共聚焦显微镜下可观察到强绿色荧光.MOI为10时转染效果最佳,转染效率>85%;RT-PCR结果表明,实验组SCL基因的表达量高于空载体组和空白组.结论 成功制备人SCL基因重组慢病毒载体,并能高效转染ICC,介导SCL基因在ICC中表达.