靶向BCOR基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立与基因编辑

• 作者: 万鸿飞 刘红刚 张红 李雪 王景文 董格红 赵艺哗
• 来源期刊: 中国医刊
• 学科: 医学
• 关键词: CRISPR/Cas9技术 基因编辑 B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子
• 年，卷（期）: 2018,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1147-1151
• 页数: 5页
• 分类号: R362
• 字数: 3071字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1008-1070.2018.10.025

摘要

目的 构建靶向B细胞淋巴瘤因子6共抑制因子(BCL6 co-repressor,BCOR)基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,并在HEK 293T细胞系中进行BCOR基因编辑,为研究BCOR的功能打下基础.方法 根据CRISPR/Cas9靶点设计规则,设计两对靶向BCOR基因的单链引导RNA(small guide RNA,sgRNA),将PX458载体进行BbsⅠ酶切,将sgRNA插入到PX458载体中,转化到宿主菌DH5α大肠埃希菌中.过夜后每个sgRNA-PX458质粒挑取3个阳性克隆,进行PCR和测序验证.挑选序列正确的BCOR sgRNA-PX458质粒,转染HEK 293T细胞,进行BCOR基因编辑,采用荧光显微镜及流式细胞学观察HEK 293T细胞绿色荧光蛋白表达的情况,确定是否成功及转染效率,提取HEK 293T细胞DNA,PCR扩增BCOR基因的相应片段,进一步Sanger测序验证,鉴定BCOR sgRNA-PX458 CRISPR/Cas9系统对BCOR基因的编辑能力和效率.结果 经测序验证,成功构建了靶向BCOR sgRNA-PX458质粒的CRISPR/Cas9系统,转染HEK 293T细胞后,可见HEK 293T细胞内有绿色荧光蛋白表达,测序鉴定发现BCOR sgRNA-PX458质粒能够产生插入或者缺失,可以成功编辑BCOR基因.结论 成功构建了靶向BCOR的sgRNA-PX458质粒,可在HEK 293T上成功编辑BCOR基因,为进一步研究BCOR的功能奠定了基础.