重组产气荚膜梭菌α毒素突变体的表达与免疫保护力评价

• 作者: 印春生 姚文生 康凯 张秀坤 彭小兵 朱真 李启红 杜吉革 薛麒 赵俊杰 陈小云
• 来源期刊: 中国兽药杂志
• 学科: 农学
• 关键词: A型产气荚膜梭菌CPA 突变 Th细胞表位 鞭毛蛋白 重组表达 毒力 抗原性
• 年，卷（期）: 2018,（9）
• 所属期刊栏目: 微生物与免疫
• 页码范围: 1-8
• 页数: 8页
• 分类号: S852.61
• 字数: 4645字
• 语种: 中文
• DOI: 10.11751/ISSN.1002-1280.2018.09.01

摘要

为获得产气荚膜梭菌α毒素(CPA)的重组突变体,并评价其毒力和免疫原性,对已知的产气荚膜梭菌CPA编码基因进行优化设计,同时引入包括第56位和第130位的天冬氨酸(D)突变为甘氨酸(G),及第275位的酪氨酸(Y)和第336位的天冬氨酸(D)突变为天冬酰胺(N)的4个氨基酸突变.此外,在该基因5'端添加Th细胞表位(T)和鞭毛蛋白(flagellin)N末端编码序列,经人工合成获得基因片段GTFNCPAm4.将GTFNCPAm4克隆至原核表达载体pET-30a(+)中进行表达与纯化,获得重组蛋白rTFNCPAm4.利用Western blot方法检测rTFNCPAm4与产气荚膜梭菌A型毒素抗血清的反应性,并检测该蛋白的卵磷脂酶和溶血活性以及对小鼠的毒力.随后,将重组蛋白与Montanide ISA 201佐剂以1:1(V/V)的比例混合乳化,免疫家兔,检测兔血清的中和抗体效价.二免后21 d,对家兔通过耳缘静脉注射1个MLD剂量的A型产气荚膜梭菌毒素,以检测rTFNCPAm4对家兔的免疫保护效果.结果表明,rTFNCPAm4主要以包涵体的形式表达,且能与A型产气荚膜梭菌毒素产生血清反应;体外实验显示,rTFNCPAm4无卵磷脂酶和溶血活性;小鼠安全性实验显示,5.5 mg/kg剂量的rTFNCPAm4对小鼠无致死性;免疫重组蛋白后,每毫升的一免抗血清可中和10个MLD、二免抗血清可中和40个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素;1个MLD的A型产气荚膜梭菌毒素攻毒后,对照组家兔4/4死亡,免疫组家兔得到了100％(4/4)的保护.以上数据说明,表达的CPA重组突变体蛋白具有良好的安全性和免疫原性,为A型产气荚膜梭菌基因工程亚单位疫苗的研制提供了重要的实验数据.