苹果褪绿叶斑病毒RT-LAMP检测方法的建立

• 作者: 任芳 张双纳 张尊平 李正男 胡国君 范旭东 董雅凤
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 苹果 苹果褪绿叶斑病毒 反转录环介导等温扩增 real-timePCR 病毒检测
• 年，卷（期）: 2018,（9）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 1706-1716
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2018.09.008

摘要

[目的]建立一种利用反转录环介导等温扩增(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)技术简便、快速检测苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)的方法.[方法]在ACLSV基因组序列的3个保守区域设计3组引物,每组引物包括一对外引物(F3/B3)和一对内引物(FIP/BIP),从3组引物中筛选出一组效果最好的引物.对RT-LAMP反应体系,即Mg2+、dNTPs、Betaine、FIP/BIP、B3/F3浓度进行优化,Mg2+浓度梯度设置为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mmol·L-1,dNTPs浓度为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L-1,Betaine浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L-1,FIP/BIP浓度为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4μmol·L-1,F3/B3浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4μmol·L-1;优化RT-LAMP反应条件,采用已优化的反应体系,设置65、63、61、59、57℃5个不同的反应温度,反应时间设定为90 min.在引物筛选和反应体系反应条件优化过程中,使用荧光定量PCR仪,在反应体系中加入荧光染料,利用荧光信号积累实时监测整个反应过程,根据扩增曲线判断反应结果.以携带苹果茎沟病毒(Apple stem grooving virus,ASGV)、苹果茎痘病毒(Apple stem pitting virus,ASPV)、苹果花叶病毒(Apple mosaic virus,ApMV)的植株叶片中提取的总RNA为模板测试RT-LAMP检测方法的特异性.将含ACLSV的叶片总RNA原液进行10倍梯度稀释,以RNA原液和10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液作为模板,进行RT-LAMP反应,测试RT-LAMP检测方法的灵敏性.随机采集23株苹果树的叶片,同时进行RT-LAMP和RT-PCR检测,加入SYBR GreenⅠ进行可视化检测.[结果]建立了ACLSV RT-LAMP检测方法,优化的检测体系为:6.0 mmol·L-1 Mg2+、1.2 mmol·L-1 dNTPs、0.2 mol·L-1 Betaine、1.6μmol·L-1 FIP/BIP和0.2μmol·L-1 F3/B3引物,最佳反应条件为59℃,60 min.特异性检测中,仅ACLSV检测结果为阳性,对照组均为阴性.灵敏性检测中,RT-LAMP方法最低可检测到10-3 RNA稀释液,灵敏度是RT-PCR方法的100倍.随机采取的23株苹果叶片样品RT-PCR阳性检出率为52.2％,RT-LAMP阳性检出率为65.2％,RT-LAMP的检出率高于RT-PCR.[结论]建立的ACLSV RT-LAMP检测方法具有简便、快速、灵敏性高、成本低等特点,可满足基层、科研部门在田间调查、种苗繁育和海关检疫中快速检测ACLSV.