家蚕微孢子虫极管蛋白2(NbPTP2)的表达、纯化和定位特征

• 作者: 刘柯柯 吕青 吴玉娇 周泽扬 易敏 王礼君 龙梦娴
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 家蚕 家蚕微孢子虫 极管蛋白2 原核表达 定位分析
• 年，卷（期）: 2019,（10）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 1830-1838
• 页数: 9页
• 字数: 6335字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.10.015

摘要

[目的]微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类.极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成.极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用.本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)极管蛋白2(NbPTP2),分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础.[方法]克隆家蚕微孢子虫NbPTP2.利用Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0和NetPhos 3.1 Server等在线软件对NbPTP2的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点.此外,利用MEGA 7.0软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白2的系统进化树.通过克隆NbPTP2,将其与原核表达载体pET32a(+)连接,构建pET32a(+)-NbPTP2重组表达质粒.将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta中,IPTG诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体.利用免疫印迹检测NbPTP2在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验(IFA)分析NbPTP2在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征.[结果]成功克隆并获得长为834 bp的NbPTP2基因序列,该蛋白编码278个氨基酸残基,理论分子质量为30.9 kD,等电点为9.39,无跨膜结构域,N端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点.系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫NbPTP2与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫NcPTP2的亲缘关系最近.Western blot结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为39 kD.IFA定位特征分析结果显示,NbPTP2能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白.[结论]明确了NbPTP2与其他微孢子虫极管蛋白2的亲缘关系,NbPTP2在成熟家蚕微孢子虫中有表达,且能定位于微孢子虫发芽后的整条极管上.研究结果可为极管的结构解析与极管蛋白功能的研究提供依据.