锌指核酸酶介导的陆川猪Fat1基因打靶载体构建及体外转基因研究

• 作者: 严爱芬 冯娟 刘连 唐冬生 张细权 朱向星 欧阳宏佳 聂庆华 邓廷贤 黄幸
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 基因打靶 锌指核酸酶(ZFN) Fat1 转基因
• 年，卷（期）: 2019,（8）
• 所属期刊栏目: 研究论文与报告
• 页码范围: 1369-1381
• 页数: 13页
• 分类号: S8
• 字数: 8439字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2019.08.005

摘要

秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans) Fat1基因翻译产物是ω-3多不饱和脂肪酸脱氢酶,哺乳动物因为缺少这个基因,不能将ω-6多不饱和脂肪酸转化为ω-3多不饱和脂肪酸,因此只能通过饮食获得(ω-3多不饱和脂肪酸,以保证ω-6/ω-3的平衡,满足机体的健康所需.为获得整合了Fat1基因且能稳定表达的转基因猪(Sus scrofa),本实验采用锌指核酸酶(zinc finger nuclease,ZFN)介导的多位点打靶技术从细胞水平上开展了转基因技术的研究.首先构建了陆川猪Fat1基因打靶载体pCAGGS-DS2-eGFP-Fat1-DS1,并设计和构建了两个靶向陆川猪rDNA基因中内转录间隔区1(internal transcribed spacer-1,ITS-1)序列的锌指核酸酶真核表达载体pcDNA3.1-NLS-ZFN-R和pcDNA3.1-NLS-ZFN-L.然后从猪的肾脏中成功分离出原代成纤维细胞(primary kidney fibroblast,PKF),通过脂质体共转染将Fat1基因打靶载体和锌指核酸酶载体导入细胞,转染细胞7d后,提取细胞基因组DNA,PCR检测外源基因整合情况,结果表明Fat1基因成功整合到陆川猪PKF细胞基因组中,本研究为进一步获得转基因猪提供了一定的理论依据.