捻转血矛线虫Hc-FAR-4蛋白的表达特性及其与配体结合能力分析

• 作者: 吴飞 周静茹 时恒枝 杜爱芳 杨怡 陈学秋 韦海典 黄艳
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 捻转血矛线虫 Hc-far-4 表达特性 配体结合能力 脂肪酸
• 年，卷（期）: 2019,（17）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 3059-3068
• 页数: 10页
• 字数: 8452字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.17.013

摘要

[目的]捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)寄生在牛羊等反刍动物的皱胃中,引起的捻转血矛线虫病在我国呈全国性流行.文章通过研究脂肪酸与视黄醇结合相关蛋白Hc-FAR-4的表达特性及配体结合能力,以了解其在捻转血矛线虫生长、发育、繁殖过程中的作用.[方法]对Hc-far-4进行克隆、并且构建原核表达载体pET-3 0a-Hc-far-4,pET-3 0a-Hc-far-4重组质粒经过PCR与双酶切鉴定准确无误之后转化到E.coli BL21感受态细胞中,用0.1 mmol·L-1 IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)进行重组蛋白的诱导表达.收集重组蛋白rHc-FAR-4,利用荧光分析法,研究rHc-FAR-4蛋白与DAUDA、视黄醇、油酸的结合能力.配体结合试验是依据荧光物质retinol与脂肪酸类似物DAUDA在极性和非极性溶液中,在某一波长的激发光激发下,所发出的荧光光谱随之变化的特性,判断rHc-FAR-4蛋白是否具有与DAUDA、retinol结合的能力.再在体系中加入非荧光长链脂肪酸油酸,根据荧光光谱的变化情况判定油酸能否分别与DAUDA、retinol竞争目的蛋白的脂肪酸结合位点,间接说明目的蛋白能否与非荧光脂肪酸油酸结合.同时制备鼠源多克隆抗体,利用ELISA技术检验免疫后小鼠的抗体效价,抗体效价合适即可收集小鼠血清.收集的血清用于免疫组织荧光(IHF)试验,探究Hc-FAR-4的表达部位,从而推测其功能.该试验过程为:对捻转血矛线虫进行石蜡包埋,石蜡切片,抗原修复,3％的BSA于4℃封闭过夜,自制鼠源多克隆抗体作为一抗孵育1 h;Alexa Fluor(R) 488 nm羊抗鼠IgG作为二抗避光孵育1 h,DAPI染色30 min,激光共聚焦显微镜检查染色情况.利用荧光定量PCR技术分析Hc-far-4在捻转血矛线虫各个主要阶段的表达特性.[结果]成功克隆目的基因Hc-far-4,测序结果与Sanger数据库中捻转血矛线虫far-4基因序列(＞HCISE00908800.t1)相似度为99.9％;重组质粒pET-30a-Hc-far-4在E.coli BL21中成功表达,在诱导8h后达到峰值.经过ELISA检测,结果显示制备的鼠源多克隆抗体效价达到1∶1 024 000-1∶2 048 000,可用于后续试验.Western Blot鉴定结果显示rHc-FAR-4重组蛋白带有His标签,并且条带大小为25 kD,结果符合预期.制备的鼠源多克隆抗体经过Western Blot鉴定,能够与天然Hc-FAR-4蛋白结合,说明该抗体可用于IHF试验.配体结合试验结果表明rHc-FAR-4蛋白具有结合脂肪酸与视黄醇的能力.荧光定量PCR分析表明,Hc-far-4在四期幼虫中的转录水平最高;IHF试验表明,Hc-FAR-4主要表达在捻转血矛线虫的肠壁、性腺中.综上推测Hc-FAR-4蛋白主要在寄生生活阶段参与了转运脂肪酸与视黄醇,为捻转血矛线虫的生长发育与生殖提供营养物质.[结论]捻转血矛线虫FAR-4蛋白能够结合脂肪酸类似物DAUDA和视黄醇,但是与油酸的结合能力较弱,主要表达在肠壁,在性腺、角皮中也有少量表达,其基因在进行营寄生生活阶段时表达量达到峰值.