捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定

• 作者: 丁豪杰 周前进 杜爱芳 杨怡 郑秀平 郭筱璐 陈学秋 黄艳
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 捻转血矛线虫 Hc-daf-22 原核表达 酶活测定 β氧化
• 年，卷（期）: 2017,（8）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 1535-1542
• 页数: 8页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.08.017

摘要

[目的]捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行.为研究捻转血矛线虫(Haem0nch uscontortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定.以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸B氧化中的作用.[方法]根据NCBI公布的丘contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(GenBank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22, 经测序鉴定正确后将其转化E coli BL21,经终浓度为0.1 mmol·L-1IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50mmol·L-1浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析.超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定.纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定.利用天然状态下的乙酰乙酰CoA (AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线.硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L-1Tris-C1 pH8.1,20 mmol·L-1 MgCl2,60 μmol·L-1CoA,10μmol·L1 AcAc-CoA,加入约0.1 μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性.在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L-1的反应体系(50 mmol·L-1 Tris-C1 pH8.1,20 mmol·L-1MgC12,60 μmol·L-1 CoA,10 μmol·L1AcAc-CoA,加入约0.1 μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件.[结果]成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的厦contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比对基因相似度为99.9％,并实现重组子pET-22b-Hc-daf-22在E.coli BL21体内进行表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示,pET-22b-Hc-daf-22基因在大肠杆菌中成功表达,呈部分可溶性,融合蛋白的分子量约为59 kD,测得蛋白浓度为1.70 μg·μL-1;针对该表达产物的酶活分析结果表明,原核表达的Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性,其最适反应pH为8.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为33.765 μmol·L1和1 784 nmol·L-1·min“.[结论]捻转血矛线虫DAF-22是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的关键酶之一,本试验通过体外酶活试验成功测定Hc-DAF-22蛋白的酶活性,证明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性,但与秀丽隐杆线虫(Caenorha bdi tis elegans)同源蛋白相比硫解酶活性较低.