野生型和功能增强型ADAMTS13蛋白酶分子的表达及功能鉴定

• 作者: 余杉杉 方颖 林蒋国
• 来源期刊: 中国组织工程研究
• 学科: 医学
• 关键词: 血管性血友病因子 野生型ADAMTS13 功能增强型ADAMTS13 血管性血友病因子A2 宿主细胞 位点突变 真核表达 原子力显微镜 生物学功能 国家自然科学基金
• 年，卷（期）: 2019,（3）
• 所属期刊栏目: 组织构建细胞学实验
• 页码范围: 441-446
• 页数: 6页
• 分类号: R446
• 字数: 7103字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.0604

摘要

背景:血管性血友病因子水解蛋白酶13(a disintegrin and metaloproteinase with a thrombospondin type 1 motif,member 13,ADAMTS13)可结合并酶切血管性血友病因子,在防止血小板过多聚集和血栓的形成中起到关键作用.重组ADAMTS13通常选择在真核细胞中表达分泌,然而对于其表达纯化目前仍缺乏一个明确高效的途径.目的:寻找合适的宿主细胞,得到稳定表达野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的细胞株,建立高纯度ADAMTS13的纯化方法,进而研究其生物学功能.方法:以野生型ADAMTS13重组质粒为模板,利用位点突变试剂盒得到功能增强型ADAMTS13重组质粒.比较CHO-S细胞、CHO-K1细胞、293T细胞对ADAMTS13的表达效果,挑选出合适的宿主细胞.通过Ni柱亲和层析和分子筛纯化蛋白;采用7.5％SDS-PAGE、Western-blot鉴定野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的纯度及特异性;利用原子力显微镜技术检测野生型及功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的相互作用,鉴定两种蛋白的活性.结果与结论:相对于CHO-S和CHO-K1,293T细胞更适合作为野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13的表达宿主;经Ni柱亲和层析和分子筛纯化后,所得到的野生型ADAMTS13和功能增强型ADAMTS13质量浓度分别为103.7,149.7 mg/L,且两种蛋白纯度均约90％;原子力显微镜检测结果显示,野生型ADAMTS13、功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的黏附频率分别为11.37％,14.70％,表明功能增强型ADAMTS13与血管性血友病因子A2的结合亲和力更高,这与近期ADAMTS13构象研究一致.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	方颖	华南理工大学生物科学与工程学院	25	53	4.0	6.0
2	余杉杉	华南理工大学生物科学与工程学院	1	0	0.0	0.0
3	林蒋国	华南理工大学生物科学与工程学院	3	3	1.0	1.0