梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

• 作者: 杨锋 杨钦淞 高雨豪 马云晶 许英 滕元文 白松龄
• 来源期刊: 园艺学报
• 关键词: 梨 愈伤组织 基因编辑 多靶点 CRISPR/Cas9
• 年，卷（期）: 2021,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文|Research Papers
• 页码范围: 873-882
• 页数: 10页
• 分类号: S661.2
• 语种: 中文
• DOI: 10.16420/j.issn.0513-353x.2020-0829

摘要

为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3∶GUS转入'茄梨'愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proDAM3∶GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型.结果 表明,共有4个转基因株系在靶位点处发生了基因突变,编辑效率为66.7％.对所有基因编辑株系的有效克隆进行分析,结果显示sgRNA1在靶位点GUST1的突变频率达到71.4％,高于sgRNA2在靶位点GUST2突变频率的46.4％,说明sgRNA1可以更有效地与靶位点结合.测序结果表明,4个基因编辑株系中GUS基因均被敲除,基因突变的类型包含碱基缺失、插入及两个靶点之间大片段的缺失,不存在碱基替换.GUS染色结果显示,基因敲除后的GUS转基因愈伤完全呈白色,说明利用CⅪSPR/Cas9多靶点基因编辑系统可以在梨愈伤组织中实现高效的基因敲除.