猪丹毒丝菌CbpB基因的克隆表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

• 作者: 刘君雯 王迪 朱艳艳 邢刚 占松鹤 刘晓露 魏建忠 孙裴 刘雪兰 李郁
• 来源期刊: 浙江农业学报
• 关键词: 猪丹毒丝菌 胆碱结合蛋白B 间接ELISA 抗体检测
• 年，卷（期）: 2021,（5）
• 所属期刊栏目: 动物科学|Animal Science
• 页码范围: 816-824
• 页数: 9页
• 分类号: S858.28
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-1524.2021.05.06

摘要

利用表达纯化的猪丹毒丝菌(ER)胆碱结合蛋白B(CbpB)建立一种检测ER抗体的间接ELISA方法.克隆扩增ER的CbpB基因并与原核表达载体pGEx-6P-1连接,经PCR、双酶切及测序鉴定,将阳性重组质粒转入E.coil BL21,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western-blot鉴定产物.以纯化重组CbpB蛋白作为包被抗原,通过一系列反应条件优化,建立检测ER抗体的间接ELISA方法(CbpB-ELISA),并用于临床猪血清样品检测.建立该方法的最适条件:包被抗原浓度为1.0μg·mL-1,4℃过夜;5％脱脂奶粉于37℃封闭2 h;血清稀释度为1:100,37℃孵育60 min;酶标二抗稀释度为1:1000,37℃作用45 min;显色时间为37℃作用10 min.该方法可特异性地检测ER抗体,与其他猪病原阳性血清均无交叉反应性;阳性血清稀释至1:12800时仍可检出;批内及批间变异系数均小于10.00％;与全菌体-ELISA、SpaA-ELISA、商品化ELISA试剂盒及Western-blot比较,该方法总符合率分别为91.67％、93.33％、86.67％和90.00％,其中阳性符合率分别为92.45％、94.55％、88.89％、90.91％,阴性符合率分别为85.71％、80.00％、66.67％、80.00％.对进行和未进行ER免疫的猪血清样品检测,免疫抗体阳性率为86.67％,感染抗体阳性率为30.50％.该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性以及临床应用的可靠性,为ER的免疫监测和流行病学调查提供了技术手段.