CRISPR/Cas9技术制备Hsf1基因敲除小鼠模型的应用研究

• 作者: 吴哲宇 周振华 吴志鹏 张雨峰 杨志强 朱宇凡 谢远龙 肖建如 蔡林
• 来源期刊: 中华骨科杂志
• 关键词: 基因敲除技术 小鼠，基因敲除 模型，动物 基因检测
• 年，卷（期）: 2021,（8）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 515-524
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.cn121113-20210224-00199

摘要

目的:探讨运用CRISPR/Cas9基因编辑技术高效构建热休克因子1（heat shock factor 1，HSF1）基因敲除的小鼠模型，为小鼠原发骨肉瘤模型建立前期基础。方法:根据Hsf1基因结构的第9外显子选择相应的gRNA（guide RNA）并进行筛选，通过PCR扩增出sgRNA（small guide RNA）转录模版，得到4个上游引物。随后将sgRNA进行体外转录并通过TubeScreen平台筛选，筛选切割有效的sgRNA，从筛选结果中选取切割效率最高的sgRNA用于后续实验。运用PCR扩增出转录spCas9mRNA的模板，接着体外转录Cas9mRNA。将体外转录得到的sgRNA与Cas9mRNA一起注射入健康的C57BL/6小鼠受精卵内，剪取出生小鼠尾巴提取组织并进行PCR测序鉴定。选取F0代杂合子母鼠与野生型公鼠交配得到F1代子鼠，结合琼脂凝胶电泳和基因测序检测F1代鼠基因碱基的突变情况。选取F1代杂合子公鼠与F0代母鼠回交得到F2代子鼠，剪取鼠尾组织并测序，最终得到F2代纯合子敲基因小鼠。运用PCR观察sgRNA切割效率与鼠尾组织的测序，通过观察凝胶电泳结果来判断小鼠是否为杂合，同时利用snapgene软件进行基因序列比对判断碱基片段缺失。结果:经PCR扩增得到上游引物sgRNA-1primer-F、sgRNA-2primer-F、sgRNA-3primer-F、sgRNA-4primer-F与下游引物sgRNAprimer-R。经过sgRNA的体外转录和筛选，sgRNA-1, sgRNA-2和sgRNA-4切割效率高，被选取用于后续实验。将T7promoter添加到Cas9mRNA的5’端，运用PCR和体外转录试剂盒得到Cas9mRNA。把混合的Cas9-sgRNA溶液注入到小鼠受精卵中并进行培养。把培养至二细胞的受精卵注射到假孕母鼠的壶腹部，并成功获得F0代小鼠。通过琼脂凝胶电泳结果判断共得到F0代杂合子小鼠8只。将F0代3号杂合子母鼠与健康的野生型公鼠繁育后，结合PCR与测序比对，共得到F1代杂合子基因敲除小鼠3只。将三只F1代杂合子公鼠与F0代3号母鼠回交，得到F2代小鼠。通过对F2代小鼠电泳和测序比对的结果观察，证实7只小鼠缺失Hsf1碱基序列，电泳结果为突变型条带且不存在野生型条带，鉴定为纯合子；得到的F2代纯合子小鼠能够稳定繁育，结果证明本实验成功建立Hsf1基因敲除小鼠模型。结论:成功运用CRISPR/Cas9技术构建Hsf1基因敲除小鼠模型，稳定性强，可重复性高，为进一步研究Hsf1基因表达产物及原发骨肉瘤小鼠模型的建立奠定了基础。