马铃薯Y病毒衣壳蛋白抗原表位分析及其快速ELISA检测方法的建立

• 作者: 梁雨欣 吴建祥 李小宇 张春雨 侯吉超 周雪平 王永志
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 马铃薯Y病毒 单克隆抗体 抗原表位 双抗夹心ELISA
• 年，卷（期）: 2021,（6）
• 所属期刊栏目: 植物保护|PLANT PROTECTION
• 页码范围: 1154-1162
• 页数: 9页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.06.007

摘要

[目的]马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施.建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑.[方法]将PVY衣壳蛋白(coat protein,CP)分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位.以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA(DAS-ELISA)对识别不同抗原表位的单克隆抗体(monoclonal antibody,MAb)进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体.通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间.以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度.以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性.同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率.运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测.[结果]利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体(9G6和3D3),并以这对单抗为基础建立了 PVY快速DAS-ELISA检测方法.以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记后以2 μg·mL-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min.该检测方法检测限为0.5 ng·mL1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒(potato virus S,PVS)、马铃薯M病毒(potato virus M,PVM)、马铃薯卷叶病毒(potato leaf-roll virus,PLRV)等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应.通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96％,且对PVY1及PVY0样品检测结果均呈阳性.[结论]建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持.