贝莱斯芽孢杆菌LJ02中植物免疫蛋白的筛选及其功能

• 作者: 魏艳侠 李卓然 张斌 苑瑜瑾 于玮玮 常若葵 王远宏
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 贝莱斯芽孢杆菌 鞭毛蛋白 免疫蛋白 珊西烟 烟草花叶病毒
• 年，卷（期）: 2021,（16）
• 所属期刊栏目: 植物保护|PLANT PROTECTION
• 页码范围: 3451-3460
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2021.16.008

摘要

[目的]贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LJ02菌株能够诱导黄瓜等植物产生免疫抗病反应.本研究从生防菌LJ02中分离鉴定具有激发植物免疫活性的蛋白分子,通过验证其功能,进一步解析免疫蛋白的免疫信号通路.[方法]用硫酸铵沉淀法处理LJ02菌株发酵液,离心获得LJ02蛋白粗提物,将其经凝胶层析后再利用半制备高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)分离,收集不同峰值处的蛋白组分.以烟草花叶病毒(tobacco mosaicvirus,TMV)为靶标进行活性组分的筛选,从而获得具有免疫活性的组分.液相质谱联用仪(LC-MS)检测分析活性组分后发现,在组分F-23中含鞭毛蛋白(flagellin,FlgLJ02).将鞭毛蛋白FlgLJ02进行原核表达并纯化,经过敏性坏死反应(hypersensitive reaction,HR)和抗病试验验证其免疫功能.为确定其主要免疫信号通路,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测水杨酸(salicylic acid,SA)和乙烯(ethylene,ET)途径的相关合成酶基因ICS1、PAL、ACS1以及免疫相关抗性基因NPR1、PR-1、EIN2和EIN3,通过免疫相关抗性基因的相对表达量解析鞭毛蛋白FlgLJ02免疫信号转导途径.[结果]HPLC层析分离出贝莱斯芽孢杆菌LJ02菌液产生的60个外泌蛋白组分(F-1—F-60),免疫烟草接种TMV后,观察分析发现组分F-20、F-23、F-41、F-44具有显著的免疫抗病效应,其中组分F-23抗TMV效果最为显著,其抑制率为81.7％.经过质谱数据分析发现该组分包含鞭毛蛋白FlgLJ02等7种物质.选择鞭毛蛋白FlgLJ02为研究对象构建表达载体,转化大肠杆菌BL21,诱导表达后破碎细胞,获得粗提蛋白.将粗提蛋白过柱、透析纯化后的FlgLJ02渗入珊西烟(Nicotiana tabacum var.xanthi)叶片,24 h后能观察到过敏性坏死反应.将FlgLJ02稀释为终浓度50、100、200μg·mL-1的稀释液后预处理珊西烟叶片,24 h后接种TMV,其对TMV的枯斑抑制率分别为65.6％、76.1％、88.1％.用鞭毛蛋白FlgLJ02处理珊西烟,其SA途径和ET信号途径的免疫抗病相关基因ICS1、PAL、NPR1、PR-1、ACS1、EIN2、EIN3的相对表达量在24—48 h均显著上调.[结论]贝莱斯芽孢杆菌LJ02外泌的鞭毛蛋白FlgLJ02可以激发珊西烟植株的免疫防御反应,提高烟草植株对TMV的抗病性.