罗氏沼虾野田村病毒和十足目虹彩病毒1二重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

• 作者: 黄玉英 杨明伟 谭红连 梁正 曾兰 韦信贤 黄光华 童桂香
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 罗氏沼虾野田村病毒（MrNV） 十足目虹彩病毒1（DIV1） TaqMan-MGB探针 二重荧光定量PCR
• 年，卷（期）: 2022,（5）
• 所属期刊栏目: 水产科学
• 页码范围: 1474-1482
• 页数: 8页
• 分类号: S945.41
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-1191.2022.05.030

摘要

【目的】建立能同时检测罗氏沼虾野田村病毒（MrNV）和十足目虹彩病毒1（DIV1）的二重荧光定量PCR，为罗氏沼虾白尾病（WTD）及虹彩病毒病（DIV1D）的临床诊断和疫情监测提供更简便和高效的检测方法。【方法】分别根据MrNV-CP基因和DIV1-MCP基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针，将目的基因片段分别克隆至pGM-T载体上制备重组质粒（pGM-T-CPMrNV和pGM-T-MCPDIV1），其中，pGM-T-CPMrNV用Sal I酶切后经体外转录获得MrNV标准品RNA，pGM-T-MCPDIV1则直接作为DIV1标准品DNA；以标准品为模板进行反应条件优化及标准曲线制定，建立可同时检测MrNV和DIV1的二重荧光定量PCR，并对该方法进行特异性、敏感性、重复性及临床应用试验。【结果】制备的MrNV标准品RNA和DIV1标准品DNA均具有很好的稳定性，可作为标准品和阳性对照使用；标准品起始模板范围为1.0×101~1.0×108 Copies/反应时，建立的标准曲线具有良好线性关系。优化后的二重荧光定量PCR灵敏度高，对标准品的检测灵敏度可达10 Copies/反应，对罗氏沼虾组织样品的检测灵敏度约10 Copies/mg；与其他虾类常见病原无交叉反应，且整个检测过程仅需1 h左右。二重荧光定量PCR检测MrNV的组内试验和组间试验变异系数分别为0.31%~0.93%和0.96%~1.33%，检测DIV1的组内试验和组间试验变异系数分别为0.35%~0.81%和0.78%~1.04%。应用建立的二重荧光定量PCR和国内现行有效标准的套式PCR分别对117份临床样品进行MrNV和DIV1检测，结果显示对MrNV和DIV1检测的符合率分别为99.15%和97.44%，且二重荧光定量PCR检测目标病毒拷贝数较低样品时较套式PCR具有更高的灵敏度。2020年广西罗氏沼虾样品MrNV和DIV1的阳性检出率分别为6.0%和11.0%。 【结论】结合TaqMan-MGB探针技术建立的二重荧光定量PCR能同时检测MrNV和DIV1，且具有灵敏度高、特异性强、重复性好、简便快速的特点，可为WTD和DIV1D的临床诊断及实时监测提供技术保障。