摘要:

目的:在耻垢分枝杆菌中表达预测的噬菌体D29裂解酶基因片段,鉴定其细胞壁裂解活性.方法:在分析分枝杆菌噬菌体D29开放阅读框序列的基础上,用PCR法从噬菌体D29基因组DNA中扩增出与裂解酶同源性较高的序列gene10,将其克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒后,在耻垢分枝杆菌中进行诱导表达.对表达产物进行SDS-PAGE检测,对诱导培养重组菌进行混浊度测定、透射电镜观察以鉴定其裂解活性.结果及结论:成功构建了重组穿梭质粒pUV-gene10并使gene10在耻垢分枝杆菌中获得表达,表达产物能有效降低宿主菌培养液混浊度,降解宿主菌细胞壁,证实gene10表达产物为噬菌体裂解酶,并推测其为非经典分泌蛋白.

摘要:

目的 建立表达人幽门螺杆菌外膜蛋白重组耻垢分枝杆菌疫苗株,为进一步应用重组耻垢分枝杆菌疫苗防治幽门螺杆菌感染打下基础.方法 利用聚合酶链反应(Polymerase chain teaction,PCR)扩增的幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因全长片段,克隆入pET32a(+),鉴定无误后,再亚克隆入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pLA71,构建pLA71-omp载体,将pLA71-omp电转化耻垢分枝杆菌,经卡那霉素筛选后,抽提质粒用PCR法鉴定,Westernblot检测omp的表达及活性.结果 从幽门螺杆菌基因组中扩增出约528 bp的基因片段.所构建重组体阳性克隆经酶切和PCR鉴定与预期结果一致,测序结果确证了插入片段的正确性,Western blot检测说明幽门螺杆菌的外膜蛋白528编码基因在分枝杆菌中获得了表达并具有良好的免疫原性.结论 成功构建了幽门螺杆菌外膜蛋白528编码基因大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒.该质粒能在E.coli/MS间进行穿梭,并在耻垢分枝杆菌中表达.

摘要:

目的构建表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌并对其免疫功能进行研究.方法采用PCR技术克隆结核分枝杆菌ESAT-6基因,构建大肠杆菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV-ESAT6,经酶切分析和DNA测序证实连接片断的正确性后,用电穿孔法将重组质粒转染到耻垢分枝杆菌mc2155中.以SDS-PAGE检测ESAT-6蛋白在重组耻垢分枝杆菌中的表达.以重组耻垢分枝杆菌感染小鼠巨噬细胞ANA-1,半定量RT-PCR检测ANA-1细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平,裂解巨噬细胞,计数胞内存活细菌数.结果重组耻垢分枝杆菌构建成功,经热诱导后可以表达相对分子质量约为6000的蛋白,与预期值一致.重组耻垢分枝杆菌能够诱导ANA-1细胞活化表达iNOS,并增强巨噬细胞的杀伤活性,重组耻垢分枝杆菌在胞内存活数低于对照组(P＜0.05).结论表达结核分枝杆菌ESAT-6基因的重组耻垢分枝杆菌具有免疫原性,为构建新型结核疫苗提供了实验基础.