摘要:

PCR技术检测28个形态发育和致病性相关T-DNA插人突变体,结果所有突变体均含磷酸转移酶基因序列.观察这些突变体的生物学性状,发现15个颜色异常,8个菌落生长缓慢,2个分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞.致病性测定结果表明,9个突变体完全丧失对抗瘟(C101)和感瘟(日本晴)水稻苗的致病能力.用标准菌株1528和P131测定突变体有性世代的形成能力,结果发现3个突变体(Y34-0211、Y34-1469和Y34-0635)完全丧失产生有性世代的能力.

摘要:

通过根癌农杆菌介导,采用叶盘转化法,探讨了黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV-CP)基因导入番茄栽培品种‘红宝石'的适宜条件. 结果表明:适宜的卡那霉素(Km)浓度、根癌农杆菌浓度、根癌农杆菌感染时间以及共培养时间分别为35 mg/L、D600约0.5、10～15 min和2～3 d;将诱导形成的抗性愈伤组织转接到含有35 mg/L Km的分化培养基和生根培养基中使其分化不定芽和生根,获得了抗Km的番茄再生植株. 对再生植株进行再次离体培养抗Km鉴定和PCR分子检测,初步证明CMV-CP基因已导入番茄再生植株的基因组中.

摘要:

为了构建香灰菌的转化体系,研究香灰菌的基因功能,需要获得高活性的启动子元件.本实验通过PCR技术分别克隆得到gpd基因以及其基因上游约1000 bp序列,使用Neural Network Promoter Prediction、Signal Scan Search Request、PLANTCAREA database软件分析发现,gpd基因上游区域内不仅包含启动子所需的特征核心元件TATA-box、CAAT-box、G-box、GC-box、CT-rich等,还含有一个高分值的转录起始位点.为进一步验证该序列的启动子功能,将gpd启动子元件与增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)和潮霉素基因(hph)连接构建成融合表达载体,通过根癌农杆菌介导将其转化香灰菌丝.潮霉素抗性筛选、绿色荧光蛋白检测结果显示,香灰菌gpd启动子成功驱动了潮霉素抗性基因和增强型绿色荧光蛋白基因的表达,根癌农杆菌介导转化成功,为香灰菌外源基因表达及基因功能的研究奠定了基础.

摘要:

在构建了两个含有潮霉素B磷酸转移酶基因双元载体的基础上,成功地实现了农杆菌介导的稻瘟病菌转化,转化效率达每1×106个分生孢子>300个转化子,并得到了4000多个转化子.通过继代培养和PCR检测,证明插入到稻瘟病菌基因组中的潮霉素抗性基因可稳定遗传.Southern杂交分析表明,大约有2/3转化子的T-DNA插入是单拷贝的.用大麦叶片离体接种的方法快速测定部分稻瘟病菌转化子的致病性,发现一个致病缺陷突变体:A1-412.该突变体不能侵入水稻叶片及擦伤的大麦或水稻叶片,说明A1-412突变体在寄主组织中扩展进程被阻断.进一步的表型分析发现A1-412突变体的产孢量显著下降,仅为野生菌株的7%,在疏水表面不能形成附着胞,部分分生孢子萌发也略有延迟.Southern 杂交显示A1-412基因组中T-DNA插入是单拷贝的.上述结果表明,A1-412突变体表型的改变可能是由于T-DNA插入而使某一具有重要生物学功能的基因失活所致.

摘要:

为改善疏水蛋白的性质,充分利用疏水蛋白和银耳的可食性优势,将平菇疏水蛋白基因hyd与去除终止密码子的hyd拼接,形成融合疏水蛋白H-H,并构建其表达载体pEGH-H-H.通过电击法将pEGH-H-H导入到根癌农杆菌EHA105中,并转化到银耳芽孢.转化子经潮霉素抗性筛选,PCR检测后,随机挑取10个转化子进行Southern blot,筛选获得高拷贝且能稳定遗传的转化子.实时荧光定量PCR分析显示5号转化子的疏水蛋白相对表达量是野生型的11.4倍.最后提取5号转化子中的融合疏水蛋白,经SDS-PAGE检测,证明融合疏水蛋白在银耳中成功异源表达.起泡性和乳化性实验表明,转化子融合疏水蛋白较平菇疏水蛋白有一定的提升.

摘要:

为建立水稻纹枯病菌的T-DNA插入诱变转化系统,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani AG-1 ⅠA)强致病力菌株GD118为转化的初始菌株,从预诱导时间、共培养时间、共培养时乙酰丁香酮的浓度、共培养温度和共培养时固体诱导培养基(SIM)的pH值等5个方面对转化条件进行了优化,成功地建立了适合于水稻纹枯病菌根癌农杆菌介导转化(ATMT)的优化系统.这个优化系统的转化条件如下:以30 μg/mL的潮霉素B作为转化子的筛选浓度,预诱导8 h,共培养20 h,共培养时固体诱导培养基上的乙酰丁香酮浓度为200 μmol/L,共培养温度25℃,共培养时固体诱导培养基pH 5.6～5.8.采用这个系统筛选到的转化子继代培养5代后,在含30 μg/mL潮霉素B的PDA平板上仍表现明显的抗性.从得到的转化子中随机抽取10个,利用根据抗潮霉素hph基因设计的特异性引物进行PCR扩增,转化子均能扩增出500 bp左右的预期条带;与此同时,以4个根癌农杆菌作为阳性对照,用根癌农杆菌Vir基因特异引物对转化子进行PCR扩增,以排除转化子受农杆菌污染所致的假阳性,结果表明:4个根癌农杆菌均能扩增出Vir基因条带(730 bp),而10个转化子均未能扩增出相应条带.以上两个PCR扩增的实验结果清楚地表明,T-DNA已经插入到目标菌株GD118中.