摘要:

目的 研究一种简便、灵敏的单核苷酸多态性(SNP)分型方法,使其能够在简单实验条件下进行常规的临床样本检测.方法 设计针对突变位点的检测探针,通过检测探针的连接、通用扩增、标记和ELISA反应,根据检测位点对应反应管显色值判定突变位点的基因型.以表皮生长因子受体(EGFR)基因外显子21和18上的3个SNP突变位点L858R、L861Q和G719C为检测对象,对62例肺癌血浆循环DNA样本进行检测,并与直接测序结果进行比较.结果 通过对3个突变位点的检测,2种方法均在L858R位点检出杂合子突变.直接测序法仅能够明确检出2例杂合子突变,另外1例样本因在突变位点出现不明显的套峰而无法明确判定突变类型.而新方法能够明确检出6例杂合子突变.结论 建立了一种基于连接酶-ELISA的简便、灵敏的SNP突变检测方法,适合于在简单实验条件下对不均一样本进行常规突变检测.

摘要:

目的 研究慢性脑缺血大鼠海马中DNA损伤修复相关蛋白脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE)、增生细胞核抗原(PCNA)的活性变化及神经元的凋亡情况,并探讨三者之间的相关性.方法 成年雄性Wistar大鼠随机均分为假手术组、持久性双侧颈总动脉结扎(2-VO)1周组、3周组、8周组,用Western blotting检测各组海马组织中APE、PCNA蛋白表达水平,用流式细胞仪检测海马神经元的凋亡程度.结果 2-VO 1周组APE、PCNA蛋白的表达量明显低于对照组(P＜0.01),随着2-VO时间的延长其蛋白表达水平逐渐上升,但仍低于对照组(P＜0.05);慢性脑缺氧大鼠术后1周时海马神经细胞凋亡百分率最高为22.66%,以后随时间的延长细胞凋亡数逐渐下降(P＜0.01).结论 慢性脑缺血大鼠早期APE、PCNA活性下降,同时其神经元凋亡率较高,后期蛋白表达水平逐渐上升,神经元的凋亡程度也逐渐下降,表明DNA损伤与修复失衡所致的神经细胞凋亡是慢性缺血性脑损伤发病的重要机制之一.

摘要:

目的 研究一种简便、灵敏的K-ras基因突变检测方法,使其适合于进行常规突变检测.方法 设计对应检测位点寡核苷酸探针,经探针的连接、扩增、标记及ELISA反应,通过ELISA反应检测值确定突变位点基因型.以K-ras基因12位密码子的G12S、G12R、G12C、G12D、G12A、G12V 6个点突变为检测对象,对72例肺癌血浆循环DNA标本进行检测,并与直接测序结果进行比较.结果 利用建立方法共检出3例标本分别存在G12S、G12R、G12A突变.而通过直接测序未能从标本中检出K-ras突变,表明直接测序方法灵敏度较低,不适合于对循环DNA等不均一标本进行突变检测.结论 建立了一种简便、灵敏的K-ras基因突变检测方法,能够对不均一标本进行常规突变检测.

摘要:

目的:将基于连接反应的可环化探针(circularizable oligonucleotide probe, C-probe)技术用于基因芯片对单碱基突变的检测.方法:可环化探针是一种检测核酸分子中单碱基突变的线性寡核苷酸分子,中间部分是通用引物结合区(约40 mer),5′端与3′端是两段与待检测的DNA分子中靶序列互补的目标序列识别区(各约20 mer).与靶序列互补结合后,可环化探针的两个末端在空间靠近并在DNA连接酶的作用下连接形成环状分子,利用荧光分子标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增,再利用基因芯片检测荧光标记的PCR产物,从而确定所检测的核苷酸位点的性质.本实验以检测CYP3A4基因外显子5中14 026位点的单核苷酸多态性为例,优化了连接反应、荧光标记通用引物的PCR扩增以及探针杂交检测等条件,并用该方法对合成模板和人基因组DNA标本进行检测.结果:以合成的寡核苷酸序列为模板进行10倍系列稀释,确定可环化探针的检测灵敏度,PCR产物的凝胶电泳结果表明,检测灵敏度达到103拷贝;可环化探针对合成的野生型和突变型模板具有良好的区分效果.用该方法检测人基因组DNA标本,芯片检测结果与测序结果符合,证实了该方法的可行性.结论:连接反应是最具特异性的酶促反应,将其与基因芯片技术结合用于单碱基突变检测,有助于简化荧光标记过程,提高检测结果的准确性.

摘要:

目的:探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注早期,皮质和尾壳核中DNA修复酶APE/Ref-1的表达变化情况及其意义.方法:40只SD大鼠单纯随机分为正常组和手术组,其中手术组根据不同时间点分为再灌注6,24和72 h组,每组10只动物.通过苏木精-伊红染色方法观察再灌注早期的损伤情况,采用免疫组化和免疫荧光方法检测APE/Ref-1的表达变化.结果:再灌注6,24,72 h,皮质损伤区域APE/Ref-1的表达分别为(28.9±8.7),(26.5±10.8),(12.8±6.8)个/视野,与正常组(68.1±12.2)个/视野比,均显著下降(F=2 182.92,P＜0.01);尾壳核损伤区域APE/Ref-1的表达分别为(21.3±9.8),(20.6±7.6),(13.5±7.3)个/视野,与正常组(72.4±14.7)个/视野比,均显著下降(F=2 453.79,P＜0.01),并始终维持于较低水平,同时皮质损伤区域细胞胞浆内出现APE/Ref-1的异常表达.结论:再灌注早期DNA修复酶APE/Ref-1表达水平的降低及其在胞浆中的滞留,提示损伤区域DNA修复功能下降,并可能因此促进DNA损伤的积累和发展.