尿激酶原变体(Ser175-His187-mscu-PA)的构建及性质

• 作者: 刘伟 刘建宁 史蔚 朱慧 薛宇鸣 马忠
• 来源期刊: 生物化学与生物物理学报（英文版）
• 关键词: 单链尿激酶 定点突变 内在酶活性 酶原三要素
• 年，卷（期）: 2000,（1）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 26-30
• 页数: 5页
• 语种: 英文

摘要

尿激酶原,即单链尿激酶(scu-PA)是双链尿激酶(tcu-PA)的前体,属于丝氨酸蛋白酶家族,但其内在酶活性高于一般的丝氨酸蛋白酶原.广泛存在于丝氨酸蛋白酶原家族中的Asp-His-Ser酶原三要素在尿激酶原中仅存Asp,为了恢复该结构,降低尿激酶原的内在酶活性,利用寡核苷酸介导的定点突变方法,将尿激酶原基因中的特定核苷酸改变,使Ala175突变为Ser175,同时Tyr187突变为His187,得到尿激酶原变体(mscu-PA)基因.该尿激酶原变体基因在大肠杆菌E.coli中获得表达.经体外变、复性,高流速SP-Sepharose 柱层析,Sephacryl S-200凝胶层析,表达产物被纯化.未突变的尿激酶原和尿激酶原变体对纤溶酶(plasmin)的敏感性表现一致.尿激酶原变体对人工合成的发色底物S2444(pyro-Glu-Gly-Arg-p-nitro-aniline)催化效率比尿激酶下降约2.5倍(表现为kcat/Km),对天然底物纤溶酶原(Glu-plasminogen)的反应速度也有所下降.双链尿激酶和双链尿激酶变体(mtcu-PA)对S2444和天然底物纤溶酶原反应的米氏动力学基本一致,kcat和Km也基本一致.说明尿激酶原在恢复了丝氨酸蛋白酶原家族中的Asp-His-Ser 酶原三要素后,其内在酶活性的确有所降低.