转录因子Cdx-2抗体的制备及对不同种属acat2启动子分析的应用

• 作者: 宋保亮 戚炜 李伯良 杨新颖 杨金波 林志新 王灿华
• 来源期刊: 生物化学与生物物理学报
• 学科: 生物学
• 关键词: Cdx-2 GST融合蛋白 多克隆抗体 EMSA acat2启动子
• 年，卷（期）: 2003,（1）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 6-12
• 页数: 7页
• 分类号: Q5
• 语种: 英文

摘要

转录因子Cdx-2是一种同源盒蛋白, 它在小肠细胞的基因表达调控和在肿瘤发生过程中起重要作用. 通过融合表达小鼠Cdx-2的保守区 (mCdx-2D)、制备Cdx-2的抗体, 进而利用该抗体检测Cdx-2在多种细胞中的表达, 以及应用于分析不同种属Cdx-2对酰基辅酶A: 胆固醇酰基转移酶-2基因(acat2)启动子的结合作用. 首先, 通过PCR扩增编码mCdx-2D的长216 bp的DNA片段, 并将其克隆到表达质粒pGEX-4T-1中, 构建了Cdx-2片段与GST的融合表达克隆pGEX-mCdx-2D; 经SDS-PAGE分析结果表明, 融合蛋白GST-mCdx-2D在大肠杆菌BL21(DE3)中得到可溶性表达; 通过亲和层析分离纯化, 获得重组表达的GST融合蛋白GST-mCdx-2D. 进而, 利用该纯化的融合蛋白免疫动物制备高滴度的Cdx-2抗血清, 经亲和吸附纯化后得到多克隆抗体. 最后, Western印迹和EMSA实验分析结果表明, 该抗体可用以检测不同种族(人和鼠)的、变性或非变性的Cdx-2, 并显示有较好的抗Cdx-2的专一性和较高的灵敏度. 同时, 观察到Cdx-2在分化的人小肠细胞Caco-2中有高表达, 显示具有分化依赖性; 从抗Cdx-2抗体能识别作用于特异结合DNA的Cdx-2而形成超迁移(supershift), 证实了Cdx-2的确结合于不同种族(小鼠和人)的acat2启动子(均存在Cdx-2元件), 提示Cdx-2可能参与acat2启动子活性的调控.