T载体的构建及日本血吸虫肌动蛋白基因PCR产物的快速克隆

• 作者: 刘述先 宋光承 徐馀信 曹建平 沈玉娟
• 来源期刊: 中国血吸虫病防治杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 日本血吸虫 肌动蛋白 PCR T载体 测序
• 年，卷（期）: 2004,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 277-280
• 页数: 4页
• 分类号: R383.24
• 字数: 3691字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1005-6661.2004.04.010

摘要

目的构建快速高效克隆PCR产物的克隆载体(T载体),并对日本血吸虫肌动蛋白全长编码基因PCR产物进行快速克隆.方法日本血吸虫肌蛋白全长编码基因的扩增采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法.质粒pGEM5Zf (+)经限制性内切酶EcoR V 酶切,在仅含有脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的PCR缓冲液中于70 ℃作用2 h,在每个片段的3'端加上一个脱氧胸苷(dT)碱基,构建成T载体.根据PCR扩增产物3'端存在一个非模板依赖的脱氧腺苷(dA)原理,将扩增产物直接克隆入T载体并测序.结果阳性克隆经琼脂糖凝胶电泳、限制性酶切分析、PCR及DNA序列测定等均证实克隆获得成功,且效率很高.与曼氏血吸虫肌动蛋白比较,核苷酸和推断的氨基酸的同源性分别是92.5%和99.7%.结论构建的pGEM5Zf-T载体对日本血吸虫肌动蛋白编码基因的PCR产物直接克隆既经济、简便,又快速、高效,所构建的T载体由于在插入位点两侧具有pUC/M13测序引物序列,可直接测定重组质粒中插入片段的核苷酸序列.所获得的日本血吸虫(大陆株)肌动蛋白编码基因与曼氏血吸虫有极高的同源性.