重组小鼠干细胞逆转录病毒载体高效基因转染CD41+、UT7、U937和MDA-MB-435细胞

• 作者: 张际青 李文林 李红 梁朝 石小玉 赵林
• 来源期刊: 中国病理生理杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 基因转染 小鼠干细胞逆转录病毒 CD41+细胞 UT7细胞 U937细胞 MDA-MB-435细胞
• 年，卷（期）: 2004,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 212-218
• 页数: 7页
• 分类号: R329.2+8|Q334+.13
• 字数: 5170字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-4718.2004.02.016

摘要

目的:研究重组小鼠干细胞逆转录病毒载体介导基因转染,探索一条高效基因转染的途径,为重组小鼠干细胞逆转录病毒载体在基因转染中的应用提供理论依据和奠定实验基础.方法: ①逆转录病毒载体的构建:EC1-4(repeats 1-4 of cadherin-5 extracellular domains)基因克隆产物和mutant(Ser 222A)MEK 1基因克隆产物,Bg1 Ⅱ和EcoR Ⅰ限制性内切核酸酶切割后,克隆进入逆转录病毒表达载体pMSCV.②CD41+细胞的获取和细胞培养:从脐带血分离的CD34+细胞通过TPO诱导表达CD41,FACS分离CD41+细胞.高糖DMEM培养液培养NIH 3T3和MDA-MB-435细胞,U937细胞培养在RPMI-1640培养液,UT7细胞是细胞因子依赖性细胞株,Iscove's modified Dulbeco's培养液中加入GM-CSF.③测定病毒滴度:逆转录病毒载体转入包装细胞293,36 h后收集病毒上清液,感染NIH 3T3细胞,流式细胞仪测定病毒滴度.④Western blot:基因转染CD41+、UT7、U937和MDA-MB-435细胞,Western blot检测基因产物的表达.结果: 293细胞产生高滴度MEK1 pMSCV病毒:3.1×107,高滴度EC1-4 pMSCV病毒:1.0×108.用稀释8倍的病毒转染基因,重组逆转录病毒MEK1 pMSCV转染白血病细胞株UT7和U973,GFP阳性细胞(转染阳性细胞)分别是60.73%、72.56%.重组逆转录病毒MEK1 pMSCV转染原代培养细胞CD41+,GFP阳性细胞为30.57%.重组逆转录病毒EC1-4 pMSCV转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-435,GFP阳性细胞为97.54%.TPO作用CD41+和UT7细胞以及血清对U973细胞的作用,显示出外源mutation MEK基因的dominant negative的效应,实验组磷酸化的MEK1减少.EC1-4基因转染的MDA-MB-435细胞表达了EC1-4基因产物.结论: 重组小鼠干细胞逆转录病毒载体能高效基因转染CD41+、UT7、U937和MDA-MB-435细胞,转染的基因能稳定地表达.