自杀基因质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD的构建及进行喉癌Hep-2细胞株转染研究

• 作者: 冯永 唐瑶云 张红茹 肖健云 赵素萍
• 来源期刊: 临床耳鼻咽喉科杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 自杀基因 酵母菌CD基因 基因治疗 喉肿瘤
• 年，卷（期）: 2005,（21）
• 所属期刊栏目: 实验研究
• 页码范围: 988-991
• 页数: 4页
• 分类号: R739.65
• 字数: 3138字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1001-1781.2005.21.010

摘要

目的:构建含酵母菌自杀基因CD的质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,并利用该载体进行喉癌Hep-2细胞株转染研究,体外实验观察前体药物5-FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞株的杀伤作用.方法:通过RT-PCR从酵母菌RNA内扩增出CD基因全长CDS序列,将其定向克隆到质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV中,重组体质粒经XhoI/HindⅢ双酶切鉴定,并对重组体中的CD基因片段进行序列分析,将鉴定好的阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD运用电穿孔法转入喉癌Hep-2细胞中.经300～600 mg/L G418正筛选14 d和10 mg/L前体药物5-FC负筛选,获得稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞株,提取该细胞株细胞的总RNA,经RT-PCR鉴定CD基因的表达.四甲基偶氮唑盐(MTT)法观察不同浓度5-FC对稳定表达CD基因的喉癌Hep-2细胞及转染空白载体pcDNA3.1(-)CMV的对照组喉癌Hep-2细胞的杀伤作用.结果:阳性重组质粒pcDNA3.1(-)CMV.CD经XhoI/HindⅢ双酶切后获得5353 bp的片段及496 bp的插入片段, DNA自动序列分析证明重组体质粒含完整的477 bp长的CD基因CDS序列.RT-PCR从转染细胞总RNA中扩出453 bp的预期片段.当添加不同浓度的5-FC时,表达CD基因的Hep-2细胞不同程度地被杀死,而对照组的细胞几乎未受到影响,两组细胞的相对生存率差异具有统计学意义(P<0.05).结论:成功构建了质粒表达载体pcDNA3.1(-)CMV.CD,建立了稳定表达酵母菌CD基因的喉癌Hep-2细胞株,表达CD基因的Hep-2细胞可以被5-FC杀死.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	肖健云	中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科	111	739	14.0	17.0
2	赵素萍	中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科	131	932	16.0	20.0
3	冯永	中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科	102	545	12.0	16.0
4	张红茹	中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科	2	18	2.0	2.0
5	唐瑶云	中南大学湘雅医院耳鼻咽喉科	30	189	8.0	13.0