短发夹RNA介导RNA干涉的实验学控制研究

• 作者: 丁兰 何国平 孙岩 张思仲 张炜 肖翠英 许文明 陈玉娟 陶大昌 马用信
• 来源期刊: 高技术通讯
• 关键词: RNA干涉 短发夹RNA 实验控制 稳定表达株
• 年，卷（期）: 2005,（3）
• 所属期刊栏目: 生物技术
• 页码范围: 64-70
• 页数: 7页
• 字数: 5227字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1002-0470.2005.03.014

摘要

采用载体介导的RNA干涉 (RNA interference,RNAi)技术抑制HEK293H细胞中外源报告基因的表达,并设置一系列的实验学控制以探讨其在RNAi应用研究中的价值及意义.运用pAVU6+27,构建了针对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的一系列短发夹RNA表达载体,并用脂质体法转染于HEK293H细胞中,检测EGFP mRNA及蛋白表达水平.瞬时转染48h后, RT-PCR及Western blot结果表明,针对EGFP三个靶点的干涉质粒均不同程度地抑制细胞内EGFP的表达,但仅转录正反义链、链内1-2个碱基错配的干涉载体不能介导特异的RNAi效应.此外,共转染实验结果表明干涉质粒两两间无相互增强或抑制的RNAi效应.在此基础上,通过G418筛选生成了HEK293H EGFP稳定表达株,在转染后不同时间点检测EGFP mRNA及蛋白表达变化,发现RNAi 效应在一定时间范围内呈现明显的时间依赖性.这些结果表明,有效的实验控制在RNAi研究中十分必要,具有重要的参考价值.基于载体表达的RNAi作用呈现明显的时间依赖性效应,为RNAi应用研究提供了一定的参考及借鉴价值.