人Survivin基因重组腺病毒载体的构建及其表达

• 作者: 刘友生 李红 王长松 葛晓东
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 腺病毒载体 基因疗法 基因,Survivin 树突细胞
• 年，卷（期）: 2005,（6）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 479-481
• 页数: 3页
• 分类号: R730.5
• 字数: 3126字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:0577-7402.2005.06.009

摘要

目的构建含有人Survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞(DC)构建DC疫苗和基因治疗奠定基础.方法自行设计一对分别含有Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ酶切位点的Survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/Survivin为模板,通过PCR扩增获得Survivin基因全序列.片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-Survivin.通过Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack-Survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒.同时将病毒上清转染成纤维细胞,通过观察GFP的表达以及Western blot分析观察Survivin蛋白表达.结果成功构建了含有人Survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1.65×108pfu/L.Western blot检测可见16.5kD的Survivin蛋白表达.结论该重组腺病毒载体的构建及成功转染到成纤维细胞内表达为下一步以人Survivin作为靶抗原的基因治疗奠定了基础.