构建人突变型p27基因重组腺病毒在结肠癌细胞SW480中的表达

• 作者: 徐少勇 熊玲 王家宁 邓长生 陈珺 黄永章
• 来源期刊: 中国临床康复
• 学科: 医学
• 关键词: 腺病毒科 结直肠肿瘤 基因疗法
• 年，卷（期）: 2005,（22）
• 所属期刊栏目: 技术方法研究
• 页码范围: 240-242
• 页数: 4页
• 分类号: R73
• 字数: 1659字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1673-8225.2005.22.085

摘要

背景:大肠癌的发病率呈明显上升趋势.以往的治疗主要为手术治疗、化学治疗和放射治疗.目前基因疗法已应用于大肠癌治疗的临床实践中.目的:构建复制缺陷型重组hp27mt基因腺病毒并检测其在SW480细胞中的表达,探讨腺病毒载体用于基因治疗的可行性及突变p27的抗肿瘤特性.设计:非随机对照实验.单位:郧阳医学院附属人民医院消化内科,郧阳医学院临床医学研究所,武汉大学中南医院消化内科.材料:实验于2002-01/2003-09在郧阳医学院临床医学研究所完成.AgeⅠ,NheⅠ,KpnⅠ,PacⅠ和PmeⅠ等限制性内切酶;Tag酶,¨DNA连接酶;Western blot检测试剂盒;鼠抗人p27kip1多抗,辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG单抗;pORF9-hp27mt质粒,腺病毒骨架质粒pAdeasy-1,穿梭质粒pShuttle-CMV,LacZ重组腺病毒,脂质体,结肠癌细胞株SW480.方法:①hp27mt自载体pORF9-hp27mt中切出,经2次亚克隆,插入到穿梭质粒pShuttle-CMV中,形成转移质粒pShuttle-CMV-hp27mt;然后再用PmeI线性化的pShuttle-CMV-hp27mt转化含腺病毒骨架质粒pAdeasy-1的超感受态BJ5183,使其在细菌内发生同源重组.重组质粒鉴定正确后经PacI酶切,转入Ad293细胞,包装成重组腺病毒Ad-hp27mt.采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定,用紫外分光光度计进行滴度测定.②用重组p27mt的腺病毒Ad-p27mt感染大肠癌细胞SW480,应用Western Blot检测p27蛋白的表达.主要观察指标:①腺病毒在Ad293细胞中的包装过程.②Ad-p27mt的聚合酶链反应检测Ad-p27mt转染大肠癌细胞后的p27mt的表达.结果:①用含pShuttle-CMV-hp27mt转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183后,可获得约30%的阳性重组质粒.②聚合酶链反应检测表明重组腺病毒DNA中含有目的基因.重组腺病毒滴度为7.95×1015pfu/L.③转染大肠癌细胞后,p27在SW480中获得了高表达,而未转染细胞和LacZ重组腺病毒转染的细胞中仅有低表达.结论:复制缺陷重组腺病毒能有效介导突变p27基因在肿瘤细胞内表达,为观察突变p27基因对大肠癌的治疗作用提供了有效的基因转移载体.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	徐少勇	郧阳医学院附属人民医院消化内科	68	210	7.0	11.0
2	邓长生	武汉大学中南医院消化内科	194	1314	18.0	24.0
3	王家宁	郧阳医学院临床医学研究所	119	709	13.0	20.0
4	黄永章	郧阳医学院临床医学研究所	66	379	11.0	16.0
5	陈珺	郧阳医学院附属人民医院消化内科	18	58	3.0	6.0
6	熊玲	郧阳医学院附属人民医院消化内科	5	16	3.0	4.0