Banna病毒TaqMan探针法RT-PCR检测方法的建立

• 作者: 付士红 何丽芳 何英 刘卫滨 孙肖红 徐丽宏 曹玉玺 梁国栋 王力华 王焕琴 王环宇
• 来源期刊: 中华实验和临床病毒学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 虫媒病毒 Taq聚合酶 聚合酶链反应
• 年，卷（期）: 2006,（1）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 47-51
• 页数: 5页
• 分类号: R3
• 字数: 5155字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2006.01.014

摘要

目的建立Banna病毒核酸特异的快速、敏感的TaqMan探针RT-PCR检测方法.方法首先对从GenBank中检索到的所有Banna病毒的序列进行同源性分析及引物、探针的设计.病毒在BHK21细胞或C6/36细胞上繁殖扩增后提取病毒RNA和逆转录.以cDNA为模板分别进行TaqMan探针法RT-PCR和传统的PCR检测,并对方法的种内广谱性和特异性、检测灵敏性以及用于蚊虫和临床标本的适用性等进行评价.结果Banna病毒核酸特异的TaqMan探针RT-PCR检测方法具有较好的种内广谱性和特异性,可以检出所有12株Banna病毒,而其他虫媒病毒如辛德毕斯病毒、乙型脑炎病毒、batai病毒和环状病毒检测结果均为阴性.与传统PCR相比,敏感性高100倍以上,可以检出每50μl标本中含有0.5CCID50的Banna病毒.单链RNA变性条件(65℃)进行逆转录使检测结果的敏感性比99VC变性法最少低10倍.病毒在室温保存1天和4℃保存1周后,检出敏感性会比原来低10倍左右.该方法在检测模拟感染Banna病毒的人血清标本以及蚊虫标本时,均显示出较好的特异性.112份蚊标本中检出6份标本阳性,4份可疑阳性,病毒分离结果3份阳性.结论本实验成功建立了Banna病毒特异性核酸的TaqMan探针RT-PCR检测方法,并初步证实可用于血清标本和媒介蚊虫标本的检测,为开展Banna病毒的流行监测及临床早期诊断提供了新的技术手段.