腺病毒介导Cubilin反义RNA对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的抑制作用

• 作者: 丁涵露 何娅妮 刘俊 张建国 李开龙 李新伦 杨聚荣 林静 梁海君
• 来源期刊: 第三军医大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: Cubilin 腺病毒 反义RNA 肾小管上皮细胞
• 年，卷（期）: 2006,（11）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 1157-1160
• 页数: 4页
• 分类号: R322.61|R373.1|R394.3
• 字数: 4159字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-5404.2006.11.008

摘要

目的构建细菌内同源重组型的Cubilin反义RNA腺病毒表达载体并研究其对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的影响.方法 PCR 扩增大鼠Cubilin起始编码区767 bp 的DNA 片段,与T载体连接,测序鉴定连接方向,通过选择反向和同向的双酶切位点与腺病毒穿梭载体pAdtack-CMV 同时酶切和连接,构建反向插入(正向插入作为对照)的腺病毒穿梭载体.将PmeⅠ线性化的腺病毒穿梭载体pAdtack-ACUB和pAdtack-CUB转染包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1 的受体菌BJ5183(AdEasyTMXL) 进行同源重组.用含有卡那霉素的LB 平板筛选同源重组阳性的克隆, PacⅠ酶切和测序鉴定后,转染包装细胞(293细胞),经病毒扩增和纯化后,再以OD 法和GFP 法计算重组腺病毒的滴度.经免疫印迹法分析Cubilin反义RNA 对Cubilin 蛋白质诱导表达的抑制作用.结果成功构建了Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-ACUB)和对照正义RNA腺病毒表达载体(pAdEasy-CUB),滴度为2.0 ×1010pfu/ ml、1.8×1010pfu/ ml;Cubilin反义RNA腺病毒表达载体转染可明显抑制大鼠肾小管上皮细胞的Cubilin 蛋白的诱导表达.结论 Cubilin的反义RNA腺病毒表达载体的成功构建以及对肾小管上皮细胞Cubilin蛋白诱导表达的明显抑制作用,为在基因水平的研究和治疗蛋白尿引起的肾间质损伤奠定了良好的基础.