uPA基因重组GFP-腺相关病毒载体质粒的构建及其表达

• 作者: 何庆南 党西强 刘喜红 刘明俊 吴小川 彭海宁 易著文 毕凌云 莫双红
• 来源期刊: 生命科学研究
• 学科: 生物学
• 关键词: uPA GFP 腺相关病毒载体 基因转染
• 年，卷（期）: 2007,（3）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 242-247
• 页数: 6页
• 分类号: Q786
• 字数: 5616字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1007-7847.2007.03.010

摘要

利用基因重组技术,用RT-PCR法从幼鼠肾脏获得uPA eDNA,再克隆到质粒pAAV-IRES-hrGFP的多克隆位点,构建重组质粒pAAV-hrGFP-uPA,通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性.采用磷酸钙共沉淀法,以重组质粒pAAV-hrGFP-uPA和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞,产生具有传染性的病毒颗粒;用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度,再将此病毒颗粒体外转染到培养的肾小管细胞中,倒置荧光显微镜观察GFP的表达,用免疫组化法检测转染的uPA蛋白表达.结果表明:成功地构建uPA基因GFP-腺相关病毒重组质粒,病毒滴度达每mL 4×1013病毒颗粒,60%～70%肾小管细胞感染了病毒颗粒,感染的肾小管细胞能稳定、高效表达外源uPA蛋白,为今后建立AAV-uPA基因治疗肾纤维化的模型奠定了良好的基础.