铜绿假单胞菌外毒素A的表达、纯化与生物学活性研究

• 作者: 丛延广 但芸婕 周莹冰 李明 申晓冬 胡晓梅 胡福泉 饶贤才 黄建军
• 来源期刊: 中华微生物学和免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 铜绿假单胞菌 外毒素A 克隆表达 蛋白纯化 细胞毒活性
• 年，卷（期）: 2007,（3）
• 所属期刊栏目: 细菌学
• 页码范围: 229-233
• 页数: 5页
• 分类号: R3
• 字数: 3738字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/j:issn:0254-5101.2007.03.008

摘要

目的 利用基因工程技术制备铜绿假单胞菌外毒素A(PE),为深入研究PE的致病机理和免疫防治奠定基础.方法 应用PCR技术从铜绿假单胞菌基因组中扩增外毒素A全长结构基因,将其克隆于原核表达载体pQE-31中,所构建的重组质粒经测序鉴定后转化大肠埃希菌JM109,IPTG诱导表达;制备融合蛋白包涵体,并采用Ni-NTA柱亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析分离和纯化目的蛋白;采用透析法对纯化后的目的蛋白进行复性,MTT法测定复性后的重组PE对L929细胞、B16黑素瘤细胞的细胞毒活性.结果 通过对PCR反应体系的优化,扩增到了PE全长结构基因.所构建的pQE-PE重组质粒经酶切及测序鉴定与设计序列一致;转化E.coli JM109后,IPTG诱导目的蛋白表达率约为25%;SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子质量(Mr)约为66×103,与理论预期值一致;破菌后电泳证实目的蛋白主要以包涵体形式表达.经亲和层析、葡聚糖凝胶过滤和阴离子交换层析后蛋白纯度大于95%.MTT法测得重组PE对L929细胞和B16黑素瘤细胞的半数抑制浓度(IC50值)分别为2.13 μg/ml、2.58 μg/ml.结论 通过对PE的表达纯化,获得了具有细胞毒活性的重组PE,为利用基因工程手段大量制备PE的工作奠定了基础.