牛IFN-γ原核表达、单克隆抗体制备及其ELISA检测方法的建立

• 作者: 张桂荣 晁彦杰 李川 胡巧云 谭亚娣 郭爱珍 钦博 陈焕春 陈颖钰 马艳
• 来源期刊: 生物工程学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 牛IFN-γ 单克隆抗体 ELISA 克隆 表达
• 年，卷（期）: 2007,（1）
• 所属期刊栏目: 基因工程
• 页码范围: 40-45
• 页数: 6页
• 分类号: Q78
• 字数: 5946字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-3061.2007.01.007

摘要

实验旨在建立牛重组IFN-γ(BovIFN-γ)的ELISA检测技术,为牛传染病的免疫学诊断提供新方法.PHA刺激体外培养的奶牛外周血白细胞,从培养细胞中提取总RNA,经过RT-PCR扩增出BovIFN-γ基因cDNA,进一步克隆至pET28a,转化大肠杆菌,经IPTG诱导,表达出预期大小(18kD左右)组氨酸标记蛋白,经鉴定为BovIFN-γ;以纯化的重组BovIFN-y为免疫原,应用淋巴细胞杂交瘤技术,获得4株能稳定分泌抗BovIFN-γ单克隆抗体的细胞株,分别命名为A7、A10、G6与G10.免疫球蛋白亚类鉴定证明杂交瘤细胞所分泌的抗体均为IgG1,腹水效价在1∶210×100～1∶211×100之间.Western-blot分析显示,4株单抗均能特异性结合重组BovIFN-γ.ELISA试验表明,4株单抗只与融合蛋白BovIFN-γ反应,而不与非相关性蛋白Ag85B、ESAT-6-CFP-10、GM-CSF等发生反应.选取A10细胞株分泌的单克隆抗体、纯化的多克隆抗体及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG,建立了检测BovIFN-γ的双抗体夹心ELISA方法.实验结果表明,此方法检测敏感性达到2ng/mL,特异性良好,为进一步建立灵敏、特异的病原感染诊断方法奠定了基础.