瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ原核表达及其多克隆抗体制备

• 作者: 曹颖颖 李宝莹 王婷 梁亮 运晨霞 唐海波 冷静
• 来源期刊: 南方农业学报
• 学科: 农学
• 关键词: 瑶山亚种树鼩 干扰素（IFN） IFN-β IFN-γ 原核表达 多克隆抗体
• 年，卷（期）: 2022,（6）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·水产·蚕桑
• 页码范围: 1713-1723
• 页数: 10页
• 分类号: S865.19
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.2095-1191.2022.06.025

摘要

【目的】构建瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ基因原核表达载体，并制备IFN-β和IFN-γ多克隆抗体，为进一步研究树鼩病毒感染动物模型打下基础。【方法】以瑶山亚种树鼩外周淋巴细胞为原材料，提取总RNA后经RT-PCR扩增瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ基因，亚克隆至质粒pcDNA3.1（+）上构建真核表达载体，并瞬时转染仓鼠肾细胞（BHK-21）；同时亚克隆到原核载体pET-28a（+）上构建原核表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后以IPTG诱导表达融合蛋白IFN-β和IFN-γ。融合蛋白纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体，并利用Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测分析其反应性。【结果】扩增获得的瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ基因片段分别为564和501 bp，亚克隆至质粒pcDNA3.1（+）上成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-IFN-β和pcDNA3.1-IFN-γ，亚克隆到原核载体pET-28a（+）上成功构建获得原核表达载体pET-28a-IFN-β和pET-28a-IFN-γ。原核表达载体pET-28a-IFN-β和pET-28a-IFN-γ转化BL21（DE3）感受态细胞后在30 ℃下以0.5 mmol/L IPTG诱导6 h即获得融合蛋白IFN-β和IFN-γ，且融合蛋白主要以包涵体形式表达，以含2 mol/L尿素的洗涤液洗涤后可获得纯度相对较高的融合蛋白，且损失较少。纯化的融合蛋白IFN-β和IFN-γ经乳化后免疫小鼠，成功制备获得IFN-β和IFN-γ多克隆抗体，Western blotting和IFA检测结果均显示这2个多克隆抗体具有良好的反应性。【结论】通过原核表达系统可在大肠杆菌中成功诱导表达获得瑶山亚种树鼩IFN-β和IFN-γ，复性后的融合蛋白具有良好的反应性和免疫原性，免疫小鼠制备获得的多克隆抗体反应性良好且抗体效价高，可作为检测工具用于研究瑶山亚种树鼩病毒感染模型。