氨基酸序列突变对TFPI生物半衰期和生物活性的影响

• 作者: 余波 冷希岗 宋丽萍 牛惠生 罗师平 赵明辉
• 来源期刊: 生物化学与生物物理进展
• 学科: 生物学
• 关键词: 组织因子途径抑制因子(TFPI) 基因突变 血浆清除
• 年，卷（期）: 2007,（4）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 382-388
• 页数: 7页
• 分类号: Q81
• 字数: 4995字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3321/j.issn:1000-3282.2007.04.008

摘要

通过对个别氨基酸突变的研究,获得了保持良好生物活性的长半衰期组织因子途径抑制因子(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)重组蛋白的有效途径.采用定点诱变和基因重组技术,首先在TFPI cDNA特定位点形成一个位点的沉默突变,以提高TFPI在毕赤酵母细胞内的表达量,此cDNA称为mTFPI.在此基础上,通过系列位点突变,形成3个羧基端突变体:m0TFPI、m1TFPI和m2TFPI.将上述4种TFPI cDNA与表达质粒pPic9连接,转染大肠杆菌,通过PCR和DNA测序确认重组质粒,转染酵母细胞GS115,甲醇诱导表达重组蛋白.采用层析方法纯化TFPI重组蛋白,用125I标记重组蛋白,静脉注射给药,比较四者在SD大鼠体内血浆代谢清除速度.用底物显色法测定重组蛋白抑制凝血因子Xa(Fxa)的活性,比较各株TFPI重组蛋白突变体在体内、体外对FXa的抑制作用及肝素对各株TFPI重组蛋白功能的影响.结果显示,相比野生型TFPI重组蛋(mTFPI)而言,3株羧基端突变体m0TFPI、m1TFPI、m2TFPI在SD大鼠体内血浆代谢清除时间均有不同程度延长,其生物代谢半衰期分别是mTFPI的1.5倍、1.9倍和大于2倍,与m-TFPI相比,3个rTFPI突变体在体内、体外抑制FXa的作用无明显减弱,与肝素的结合能力及协同能力也无明显减弱.结果表明,m0TFPI、m1TFPI和m2TFPI在生物半衰期得到明显延长的同时,仍保持良好的抑制Fxa的生物活性.